荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)是利用碱基互补的性质，将荧光素标记的探针与组织、细胞核或染色体DNA进行杂交，对细胞中待测核酸进行定性、定位及定量，将染色体复杂和微细的畸变或基因突变清楚显现的细胞遗传学技术[1,2]。该检测无需细胞培养，分析周期短，灵敏度和特异度均较高[3,4,5]，可以快速检出胎儿常见的染色体非整倍体异常，从而解决染色体核型分析诊断周期长、培养不确定性等问题。FISH还可以分辨一些微小缺失及复杂易位[6]，弥补常规以及高分辨染色体显带技术以及人眼分辨力的局限性，提高分辨精度，扩大检测范围。为推动FISH技术在临床的规范应用，国内外许多学会已制定了相关的指南与专家共识[7,8,9,10]。中国医院协会临床检验专业委员会出生缺陷防控实验技术与管理学组专家进行充分讨论，拟对实验室作出进一步的规范和建议，以指导FISH技术在产前诊断领域的应用。
(1)确定异常染色体的来源 对于核型分析较难归类的环状染色体、双随体双着丝粒的标记染色体、染色体附加片段及染色体重排等，可用FISH探针进一步证实染色体的带型，确定异常染色体的来源。
(2)基因定位 利用特异的FISH探针与分裂中期细胞DNA进行原位杂交，不仅可以定位特定基因或DNA片段在染色体上的位置，还可以根据不同颜色的杂交信号的相对位置，确定两种或以上的基因在染色体上的排列次序。
(3)产前诊断 对胎儿常见的13、18、21、X、Y等染色体非整倍性异常进行快速产前诊断。
(4)辅助染色体病的诊断 对产前(或出生后)核型分析或其他分子细胞遗传学检测(如染色体微阵列分析)所提示的异常进行验证。
(1)无创产前检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)提示的13、18、21和性染色体数目异常、需要进一步明确诊断者；染色体异常嵌合的诊断，对嵌合比例做出较为准确的判断。
(2)FISH技术与经典细胞遗传学技术(染色体核型分析)的联合应用，对所有具备侵入性细胞遗传学产前诊断指征的胎儿进行检测(参照细胞遗传学产前诊断指征)，有助于尽早获得胎儿常见染色体数目的信息。
(3)对于孕周过大、染色体核型分析细胞培养失败或其他原因不能行细胞遗传学产前诊断者，FISH技术可作为补救诊断手段之一，能提供常见染色体非整倍体异常的检测。
(4)FISH技术与其他分子遗传学诊断技术联合应用时，可同时采用FISH获得13、18、21、X、Y等染色体数目的信息。包括在进行单基因遗传病分子诊断时，同时进行FISH检测有助于排除常见染色体数目异常的情况[11]；在其他分子遗传学诊断技术(如QF-PCR、BoBs等)诊断结果不明确时，可采用FISH技术进行验证。
(1)产前FISH通常仅对胎儿常见的13、18、21、X、Y染色体的非整倍体进行检测，而未涵盖其他的染色体数目异常；
(2)与全基因组高通量测序相比，FISH仅能检测染色体上非常有限的已知位置，并不能检测未知变化；
(3)在非特殊情况下，未对染色体结构异常进行检测。
鉴于其技术的局限性，FISH不能完全替代传统的染色体核型分析。
开展产前FISH检测的应当为有资质的产前诊断机构，并严格遵守《医疗机构临床实验室管理办法》等相关规定。
从事产前筛查与诊断的专业技术人员必须按照《产前诊断技术管理办法》相关规定，经过系统的产前诊断技术专业培训，通过省级卫生行政部门的考核并获得从事产前诊断工作的《母婴保健技术考核合格证书》，并获得省级卫生行政部门组织的基因扩增培训合格证书。
每份FISH报告应由至少两名具有产前诊断资质的人员进行分析，最终临床报告应由副高以上职称、并具备产前诊断资质的临床医师签发。
实验室人员除定期参加国家组织的产前诊断培训班外，还应定期或不定期组织学习及复杂病例讨论。
FISH实验室产前筛查与诊断配套的主要仪器设备。设备、试剂和数据分析软件应当符合《医疗器械监督管理条例》和《医疗器械注册管理办法》等相关规定，经过中国食品药品监督管理总局(CFDA)认可，批准注册的用于常见染色体非整倍体产前检测的商品化探针试剂盒，证照资质齐全、合法，统一由专人采购记录。实验室应选择合格的供应商，并定期对供应商进行评价。实验室应当建立供应品的检验、接收和保存的程序及标准。
实验室要求有空气调节、通风、温湿度、清洁度控制、给水改造，酸碱废水及剧毒和致癌物质的排放，气体供应，电气改造等，使实验室的场地环境条件满足相关法规、技术规范和标准的要求。实验室的标准温度为20℃，一般检测间的温度应为(20 ± 5)℃，相对湿度一般应保持在50%～70%。
实验室设计试剂准备室、标本制备室、暗室。实验室各工作房间有明确的标记，及时记录实验的温度及湿度。实验室应有足够的温度适宜的储存空间，用以保存临床样品和试剂，冷库或冰箱均应由温度监控记录。
鉴于FISH技术在产前诊断应用中的优点和局限性，在进行胎儿检测的前后，应进行适当的产前咨询，主要包括以下内容。
产前咨询应由有资质的专业医务人员承担。医师应了解孕妇的个人史、既往史、孕产史、遗传病家族史、FISH产前诊断的指征等，帮助孕妇正确理解胎儿可能罹患染色体病的风险以及临床表现，FISH检测染色体非整倍体异常的利弊等，帮助孕妇及亲属在充分知情后选择检测项目，并签署知情同意书；医师应在取样手术前开具必要的术前检查项目，并排除孕妇侵入性取材手术的禁忌证。
FISH技术用于胎儿染色体非整倍体异常检测前的咨询应详细解释其优点和局限性，须对准备受检的孕妇及亲属签署知情同意书，使受检者充分知情同意，明确指出：
(1)FISH能够检出胎儿常见的13、18、21、X、Y染色体非整倍体异常，而不能诊断其他染色体数目异常及染色体结构异常；
(2)FISH不能检出单基因或多基因遗传病，或其他原因(包括药物)导致的胎儿畸形或异常；
(3)FISH检测结果正常，胎儿仍有可能因其他因素导致出生缺陷或智力发育不全；
(4)由于现有医学技术的局限性，FISH检测不可能做到完全准确，某些嵌合体异常可能难以检出；细胞过少、母体污染等因素可能导致无法得出结果或使结果不准确等。
(5)FISH检测结果异常的咨询：告知受检孕妇及其亲属FISH检测结果异常的临床意义、胎儿的预后及风险以及再次发生的可能及风险等。
6.1 样本类型 可检测绒毛、羊水、脐血等标本。
6.2 标本类型 孕妇羊水合格羊水标本性状：羊水颜色淡黄、清/微混、无血量、无凝块、无味。如果羊水中含有少量血样需加肝素抗凝，排除母体细胞污染；如果血液量过多，建议重新取样。羊水取出母体后，也可保存在4℃，1～2天，存放时间较长可影响检测结果。
6.3 标本采集的操作程序参照卫生行业标准WS322.2-2010附录B.1执行，采集羊水的时间建议为17～32周。收到样本后，实验室人员应逐一检查原始样本标识、收集管类型、运输条件、运输时间、样本颜色、样本状态(是否有凝块、溶血等)以及与申请单信息的一致性和完整性。不符合检测要求的样本，因其他因素的不确定性，有可能导致假阳性或假阴性结果，影响检测的准确性。实验室可拒绝接收不符合检测要求的样本，并标明拒收的原因，将信息反馈给取样人员，符合要求的样本信息均及时录入到样本收录系统。
(1)试剂耗材：生理盐水、氯化钾低渗溶液、甲醇、冰醋酸等。
(2)仪器设备：无菌剪刀或镊子、培养皿、量筒、移液器、塑料吸管、离心管、镊子、载玻片、盖玻片、计时器、温度计、水浴锅、显微镜等。
(3)玻片制备程序：
(4)取新鲜羊水盛于15 mL离心管中，1500 r/min，离心10 min。
(5)低渗。加入5 mL预热至37℃的0.075 mol/L KCl溶液，37℃低渗20 min，期间轻轻吹打悬浮细胞2～3次。
(6)预固定。缓慢加入2 mL固定液(甲醇∶冰乙酸＝3∶1)，轻轻轻吹打混匀后1500 r/min，离心10 min。
(7)固定。去上清，加入5 mL固定液，混匀，静置10 min，期间吹打1次，1500 r/min，离心10 min。
(8)固定。重复步骤5。
(9)消化。去上清，加1 mL冰醋酸消化约1 min，加3 mL甲醇终止消化。
(10)细胞悬液的制备和保存。离心，去上清，根据细胞量加适量固定液混匀后滴片。
(11)老化玻片。室温下过夜或56℃烤片至少2 h。室温干燥保存。
(1)试剂耗材：2× SSC、0.01 mol/L HCl、胃蛋白酶工作液、乙醇、甲酰胺等
(2)仪器设备：水浴锅、计时器、温度计、镊子、Eppendorf管、pH计、移液器、杂交仪、盖玻片等。
(3)玻片预处理程序：
(4)室温下于2× SSC(pH 7.0)溶液中漂洗玻片5 min。
(5)消化。37℃下终浓度0.08 mg/mL胃蛋白酶工作消化5 min，可根据实际情况进行调整。
(6)室温下于2× SSC(pH 7.0)溶液中漂洗5 min。
(7)将玻片依次置于70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各3 min脱水，自然干燥。
(8)探针配制。
(9)离心1～3 s，涡旋混匀后再次短暂离心。
(10)变性杂交(杂交仪变性和甲酰胺变性任选一种)
(11)杂交仪变性杂交(自动操作)
(12)将10 μL探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。
(13)杂交仪共变性。共变性条件：75℃，5 min，杂交条件：42℃，16 h。
(14)玻片变性。将玻片在(73 ± 1)℃的变性液中浸泡5 min，依次置于预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各3 min进行梯度脱水。
(15)玻片自然干燥后，置于45℃～50℃烤片机上预热2～5 min后与探针杂交。若以下探针混合物尚未完成变性，玻片可置于45℃～50℃烤片机上较长时间预热。
(16)将10 μL变性后的探针混合物滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。
(17)将玻片置于预热的湿盒中，42℃保温箱中过夜杂交。
(1)试剂耗材：2× SSC、0.1%NP-40/2× SSC、70%乙醇等；
(2)仪器设备：水浴锅、计时器、温度计等；
(3)玻片预处理程序：
(4)移除盖玻片，立即放入46℃水浴锅2× SSC溶液中，漂洗10 min，振荡1～3 s；
(5)将玻片置于46℃水浴锅0.1%NP-40/2× SSC溶液中，漂洗5 min，振荡1～3 s；
(6)将玻片室温浸泡在70%乙醇中，漂洗3 min，自然干燥。
(1)暗处自然干燥玻片。
(2)将15 μL DAPI复染剂加至目标区域置，立即盖上盖玻片。暗处放置10～20 min后观察标本也可放在-20℃过夜，效果会更好。
(1)经腹抽取绒毛10～20 mg，置于无菌培养皿中，加入5 mL双抗水进行洗涤；将绒毛组织再次倒入培养皿中清洗2～3次，在倒置显微镜下去除血水和蜕膜；加入1～2 mL EDTA-胰酶消化，37℃水浴15～30 min，吸去上清；加入1～2 mL低渗液，37℃水浴15 min；加入1～2 mL固定液预固定，混匀后吸去上清；加入1～2 mL固定液固定两次，每次常温放置5 min；吸去上清，加入1 mL 60%乙酸，将细胞吹打下来，同时将玻片置于65℃烤片机上，滴片。烤片15～30 min。
(2)改良FISH(三步法)步骤：向烤干的玻片上加上探针，封片，18/X/Y探针73℃共变性(40 ±10)s，21/13探针75℃共变性3 min左右，放入湿盒中，置于37℃水浴箱中过夜。
将外周血3500 r/min，离心10 min，吸取中间层白细胞，操作方法同羊水。
(1)每份FISH结果由两位阅片人独立阅片；选择各通道信号均清晰可辨、信号强度均一、信号边缘圆润、背景干净、单一无重叠的细胞进行计数。红色信号表示21号染色体，绿色信号表示13号染色体。染色体数目正常的细胞显示2个红色荧光点及2个绿色荧光点，另一张玻片的红色信号表示X染色体，绿色信号表示Y染色体，蓝色信号表示18号染色体，偶可见极微弱的散在荧光杂点，但不影响结果判断；杂交失败的细胞形态正常，包膜完整清晰，但背景常较明亮，伴有胞核内散在的荧光信号，导致无法辨识或者难以确认。
(2)每组探针随机计数50个细胞；如发现1个以上信号异常的细胞，则建议扩大计数至100个细胞，遇染色体嵌合体时，可扩大至50～500个细胞，精确计算染色体的嵌合比例。
(3)单独判断每种指标，正常细胞的比例≥ 90%，异常细胞的比例< 10%，提示该指标未见异常。
(4)某种指标异常细胞的比例≥ 10%，提示该指标异常(异常细胞的比例介于10%～60%之间者提示为嵌合，扩大计数到100个细胞)。
(1)产前诊断实验室至少采用一种其他方法(如核型分析、QF-PCR、BoBs)进行验证后，再发放FISH产前诊断报告。报告规范建议采用人类细胞遗传学命名国际体系(ISCN，2016)进行描述[12]，同时有必要地解释结果，正常的性染色体结果不应显示在报告中。
(2)实验室发放的FISH检测报告应明确FISH的检测内容、范围、局限性以及验证的方法。
(3)每份FISH报告应至少由两名具有产前诊断资质的人员进行分析，两人计数结果的误差应控制在10%以内；若大于10%，则需另一位专业技术人员再进行计数，必要时需重做一次FISH以保证结果准确可靠，并由审核者(副高以上职称并具备产前诊断资质的临床医师)在报告上签名方可发放最终报告，报告发放时间建议为3～5个工作日。
(1)针对每例产前诊断每个探针的检测结果，至少有3个细胞图像的记录并保存；
(2)FISH检测的荧光玻片保存时间有限，猝灭时间通常为30～60天，保存时间至少等染色体核型报告发出；
(3)悬浊液能保存半年以上，每次实验完成前必须保存备份标本3 mL以上，以备后期验证。
产前诊断实验室建议至少采用一种其他方法(如核型分析、QF-PCR、BoBs)进行验证后，再发放FISH快速产前诊断报告。报告内容按照人类细胞遗传学命名国际体系(ISCN，2016)进行描述[12]。
FISH检测实验室需建立标准作业程序(standard operation procedure, SOP文件体系，以确保检测各环节标准、有序进行，确保检测结果的真实性、准确性和可重复性。羊水样本的颜色应为淡黄、清/微混、无血量、无凝块，已排除母体细胞污染。应采用经国家食品药品监督管理局批准注册的、用于常见染色体非整倍体产前检测的商品化试剂盒，设立阳性和阴性质控，所有重要环节均需双人核对。
各实验环节(如洗片、滴片、探针配制、探针滴加等)均需要建立实验室质量管理体系文件和SOP，有严格的室内质控措施；实验的关键环节要求双人反复核对信息，每个环节都做好检验记录。各阶段实验室质量控制指标包括：
(1)杂交仪工作时应保证密封状态，记录仪器的温度；
(2)试剂冰箱，每天记录标本冰箱的温控；
(3)考菩林瓶使用时应加盖，以保证瓶内温度均一、稳定；
(4)水浴锅的温度应每天记录，并用温度计测量其温度显示是否正常；
(5)杂交时必须对玻片的变性温度进行摸索。
(1)低渗时间控制，足够的低渗液时间及合适的温度才能让细胞展开，利于杂交。如遇到羊水标本有少量母血污染，应将低渗时间缩短，让胎儿上皮细胞与母体细胞容易区分(核形态的区分，上皮细胞细胞核呈不规则的椭圆形，血细胞核呈规则圆形。在低渗20 min的情况下，上皮细胞能够观察到带膜，血细胞为裸核状态)；
(2)洗涤时间控制，洗脱步骤很关键，增加洗脱时间，升高温度或降低SSC溶液盐酸浓度均可导致信号减弱甚至消失，反之可导致背景信号增强；
(3)烤片时间控制：烤片时间过长，DNA降解，信号杂交不上；烤片时间过短容易掉片；
(4)胃蛋白酶工作液的时间控制：消化时间过长，容易呈空核；消化时间过短，信号不易杂交(一般做2～3张片子梯度消化，摸索适合本实验室的胃蛋白酶工作时间)。
比如新配的20× SSC 0.1%NP-40/2× SSC 2× SSC保存3个月，1 mol/L HCl保存1个月，荧光素应注意避光保存。
大多数实验操作以及阅片均应在暗室中进行，以减少探针荧光信号的猝灭，并及时快速地阅片，如不能及时阅读完或信号较弱时，可将其存放于-20℃避光过夜。
滴片的浓度不宜过稀(难以找到足够符合要求的细胞)或过密(细胞核重叠，无法计数)。
例如玻片的清洁度(防止背景过强)，杂交过程中应保持湿润，离心转速(过高的转速能使固定的细胞发生形态改变，尤其是在低渗后细胞核膨胀，比较脆弱)。
若FISH检测结果为染色体非整倍体异常，建议采用其他技术(如QF-PCR、BoBs或染色体核型分析)进行验证。对绒毛标本异常的诊断应慎重。不能排除存在胎盘局限性嵌合情况时，建议于中孕期行羊水细胞染色体核型分析以确诊。告知受检孕妇及其家属FISH检测结果异常的临床意义、胎儿的预后及风险以及再次发生的可能及风险等。
实验室应建立相应的安全技术路线及质量控制措施，排除母体细胞污染(maternal cell contamination，MCC)[13]。羊水细胞离心后，若血细胞比率大于1/2，则该样本应不用于FISH检测；若仍进行FISH检测，并显示为女性(XX)结果，认为该分析结果不可靠。男性胎儿羊水样本检测出现女性细胞的数目大于总计数的10%时，提示羊水样本可能存在母体细胞的污染。在10%左右羊水过少的孕妇中，羊水样本可能被大量母体细胞污染，造成FISH结果不准确。对怀疑存在MCC的标本，建议在诊断实验的同时进行MCC鉴定(如采用QF-PCR)。若无法排除MCC，则应在报告中予以说明，并通知临床医师，向被检者详细说明情况，并记录在病历系统中。
应定期参加国家卫健委临床检验中心组织的室间质量评价，并有持续的质量保证和改进计划。
(1)将所有的结果录入相应的软件系统，记录完整的患者信息；
(2)与最终的染色体核型进行复核，分析灵敏度、特异度和准确率；
(3)对FISH产前诊断的病例进行随访，了解并记录胎儿的发育情况以及妊娠结局；
(4)每个季度及半年做一次总结，绘制曲线图及报表，分析结果。
共识专家组成员(按姓氏笔划排序)：
国家卫生健康委员会临床检验中心/北京医院国家老年医学中心(王治国)；湖北省妇幼保健院检验科(王维鹏)；海南省妇幼保健院(王洁)；河南省人民医院医学遗传研究所(王莉)；江苏省妇幼保健院(王珏)；内蒙古自治区妇幼保健院(王晓华)；浙江大学医学院附属儿童医院浙江省新生儿疾病筛查中心(曲一平)；河北省保定市妇幼保健院(李伟)；青岛大学附属医院(刘世国、王敬丽、张铷、刘文森)；沈阳市妇幼保健院(张莉)；湖州市妇幼保健院(沈国松)；浙江大学医学院附属儿童医院(黄新文)；广西壮族自治区妇幼保健院(范歆)；厦门市妇幼保健院(周裕林)；吉林大学第一医院(姜艳芳)；徐州市妇幼保健院(顾茂胜)；福建省妇幼保健院(徐两蒲)；上海交通大学附属第一人民医院(陶炯)；湖南省妇幼保健院(唐华)；山东大学附属省立医院产前诊断中心(贾颐舫)；陕西省妇幼保健院(强荣)；大连市妇幼保健院(曹东华)；梅州市妇女儿童医院(黄烁丹)；广州医科大学附属第三医院妇产科研究所(黎青)
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
