免疫组织化学是在组织切片或细胞涂片上，利用抗体检测抗原并将其可视化的技术。在个性化的精准医疗时代，免疫组织化学技术主要用于病理诊断、鉴别诊断、判断疾病的预后和评估临床疗效、对分子靶标进行定位指导治疗以及对未分化和异质性的肿瘤进行研究，已经成为病理诊断中不可或缺的技术手段，其结果的准确性和可重复性需要整个检测体系的质量控制。
目前免疫组织化学检测技术在地域、医院、科室和人员之间存在较大差异，由于缺少规范，在实际操作过程中存在许多问题。为此免疫组织化学检测标准化、规范化和可溯源性势在必行。强调质量控制涉及组织处理、检测中间流程及结果判读等各个环节。
国内发表的各项临床指南/专家共识中都涉及对组织处理的要求，技术人员应及时了解并掌握最新进展，并根据国内相关检测指南的更新进行调整。
固定的意义是保存组织细胞的抗原性，使抗原物质不发生弥散和抗原性丧失[1]。越来越多的研究及实验数据表明，不标准的组织固定是导致免疫组织化学结果不准确的主要因素。
常规固定必须使用3.7%中性缓冲甲醛（pH 7.2~7.4）。组织离体后应尽可能在30~60 min内开始固定[2,3]。延迟固定引起的蛋白质降解可导致背景非特异性着色增加，减弱免疫组织化学的染色强度[4,5,6,7]。
固定不均匀将会导致免疫反应的异质性；而固定过度（固定时间>72 h）或固定不足（固定时间<6 h）会导致免疫反应性降低或完全丧失、干扰免疫活性。标准条件为组织规范剖开后置于不少于自身体积4~10倍的中性缓冲甲醛固定液中，依据组织大小，固定时间为6~48 h[2,3]，对于活检小组织固定时间亦不应少于6 h。固定不足是目前病理科应高度重视的问题。
脱钙剂有可能造成抗原丢失，抗原修复也无法恢复丢失的抗原，无法保证免疫组织化学检测的可靠性。建议脱钙组织的免疫组织化学检测报告应注明组织经过脱钙处理和使用的脱钙方法。
组织处理过程包括脱水、透明和浸蜡三个阶段。科室需根据实际情况，通过严格的测试，制定标准化的组织脱水、透明、浸蜡流程及试剂更换程序。
建议使用自动组织脱水机和梯度乙醇脱水方案，如70%乙醇➝85%乙醇➝95%乙醇×2➝无水乙醇，根据处理组织的类型和大小以及脱水机的工作效率，每种梯度乙醇的作用时间可设定为60~120 min。脱水时间不足会导致后续染色效果不佳。二甲苯作为组织透明剂广泛使用在组织处理环节，建议使用两道透明剂，每道时间约15~60 min。未及时更换试剂易造成组织处理不良。
每日必须监控组织脱水机中的石蜡温度和缸内的石蜡体积，经常更换和补充石蜡。浸蜡需经过2~3次浸蜡程序，每次时间为30~90 min不等。在组织处理的任何过程中，标本干涸组织形态和抗原会受到损害。
恰当的组织处理是获得优质免疫组织化学制片的前提，组织处理应严格按照科室相关标准化操作程序（SOP）文件的要求进行。
组织平放于包埋模具中，根据组织的类型决定包埋方向。
免疫组织化学应使用防脱玻片，切片厚度为3~5 μm，切片过薄会导致抗原减少从而抗体阳性表达减弱，切片太厚极易在抗原修复中脱片且影响观察。确保石蜡切片与载玻片间无气泡，如有气泡可能会导致局灶性非特异性染色。推荐烤片温度高于石蜡熔点2~3 ℃，60~120 min，忌高温长时间烤片。
免疫组织化学检测应尽量使用新鲜切片（1周以内的切片视为新鲜切片）[8]。切片最好在2周内进行免疫组织化学检测，如2周后检测，有实验室推荐将切片密封后放入冰箱冷藏，并于1个月内完成相关检测。石蜡切片长久放置后免疫稳定性的丢失会导致染色强度降低、阳性细胞的数量减少。有文献报道超过20年的蜡块进行免疫组织化学检测时亦观察到此现象[8,9]，并且这些影响在存档5年后的蜡块RNA水平检测中也会观察到。
通常使用二甲苯脱蜡，浸泡3次，每次3 min。梯度乙醇的顺序为100%×2、95%×2、70%×2，每种梯度乙醇中浸泡1~3 min。脱蜡不足是免疫组织化学染色失败的最常见原因。脱蜡用二甲苯必须经常更换，防止脱蜡不完全导致的染色失败，并可根据实际情况延长脱蜡时间，脱蜡液的更换时间及方式应登记在免疫组织化学日常质控登记表中。可使用水性脱蜡剂和水化试剂[10]，其具有脱蜡、水化和抗原修复"三合一"功效，可以加热，使用时应严格参照说明书中脱蜡片数和次数的规定。
常用的抗原修复方法有酶消化法和热修复法。酶消化由于蛋白水解会破坏组织形态，因此需选择性使用，严格控制浓度和作用时间。而热修复最常用的修复液为pH6~10之间的柠檬酸盐溶液和乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。加热的方法有水浴、高压、微波或高压蒸汽，主要推荐高压和水浴修复方式。根据加热方法不同，持续时间2~30 min不等，加热时间可优化调整。控制精确的温度和时间是达到最佳抗原修复的关键，也是获得最佳且稳定的染色结果的关键。禁止使用家用微波炉进行抗原修复处理。可根据抗体说明书选择适宜的抗原修复方式，抗原修复的方法、修复液的配制及更换、修复液的pH值及具体修复条件等，均应及时登记在免疫组织化学日常质控表中。
封闭是免疫组织化学检测中处理非特异性干扰的常用方法。
非特异性着色通常是均匀的，可通过滴加与二抗种属同源的被稀释后的非免疫性血清降低背景。
许多组织中存在内源性过氧化物酶，可通过与底物3,3′-二氨基联苯胺（DAB）结合而着色。在一抗孵育前，通过3% H2O2灭活内源性过氧化物酶活性。部分组织还含有内源性碱性磷酸酶（AP），可选用左旋咪唑预处理进行灭活。
生物素存在于各种组织中。使用生物素标记的检测系统，链霉卵白素会与内源性生物素结合产生背景染色。冷冻组织内内源性生物素含量更高，可以用未标记的卵白素进行处理，通常可选用新鲜的蛋清溶液。
新抗体在用于诊断前，必须摸索其最佳反应条件。不同厂家生产的克隆号相同的抗体其效价也不尽相同，必须在使用前进行验证，达到预期结果方可用于临床检测。新抗体购入科室后，应立即进行试剂验收，其内容包括：抗体名称、克隆号、抗体种属、剂型、规格、生产批号和有效期等信息。并在最短时间内对到货的抗体进行验证，内容包括：抗体效价、阳性组织、阴性组织、染色定位等。对于同一时间送货的同批次同种试剂可选择其中一支进行验证，而对于非同一时间送货的同批号试剂建议再次验证。经实验室验证合格后方可进行相关抗体信息的登记入库，并用于临床诊断。入库抗体应按照说明书中提供的方式进行贮存，-20 ℃贮存的抗体如果需要多次使用，须进行分装，以防多次冻融降低抗体效价。
在免疫组织化学检测中取得最佳染色时所用抗体的最大稀释度即为抗体效价。所谓最佳染色即阳性最强、背景最小、反差效果最好。最佳染色时染色强度应具有差异，而非细胞着色模糊一片、强弱不分。由于肿瘤组织中蛋白表达不均一，因此在预实验中需要选取多种肿瘤组织多种抗体浓度精确评估蛋白的表达。
对于浓缩型抗体每个新批次均需进行"滴定"试验。如果使用的二抗为已备案的免疫组织化学试剂，一抗只需简单滴定测试即可。抗体梯度测试范围从推荐稀释度的高于2倍至低于2倍之间确定最佳抗体稀释度。体外诊断试剂的即用型一抗和检测系统，则不需要再进行"棋盘滴定"测试。
抗体稀释液为添加蛋白稳定剂的缓冲液（例如PBS和Tris），利于稳定和保持抗体的免疫活性。增强型稀释液可以允许更高的稀释倍数，减少背景染色。
根据产品说明书要求和组织切片的前处理情况确定抗体的孵育时间和温度，可针对不同情况进行调整。应避免长时间的高温孵育，防止干片或形态损害。
常用的一抗孵育时间和温度，室温：30~240 min；4 ℃：过夜；37 ℃：30~60 min。孵育时载玻片应置于湿盒封闭空间内，防止抗体蒸发。
在销售前即根据用途专门配制，其浓度和检测流程均被优化，确保试剂性能和不同批次间的稳定性，不需要使用者再行调整。
体外诊断即用型检测系统确保了结果的一致性，实验室可根据自身情况选用不同的检测试剂盒或抗体。体外诊断试剂在其产品说明书中会提供优化了的检测流程、产品性能特征和有效期等信息，其二抗孵育时间和温度以说明书为准。
根据所标记酶的不同选择不同的显色剂，最终产物的颜色亦不同。多次的显色会2倍、3倍放大染色结果。辣根过氧化物酶的常用显色剂为DAB或3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）。DAB显色为褐色产物，AEC显色为醇溶性红褐色产物。常用DAB显色时间为室温5~10 min。AP常用的显色剂是5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝（BCIP/NBT）、氯化四氮邻二甲氧基苯胺（Fast blue）和1,5-苯二磺酸盐（Fast red），产物溶于乙醇，需要使用水溶性封片剂。
最佳的对比染色颜色与显色结果有强烈反差，且不干扰观察较弱的染色结果。对比染色时还需考虑封片剂的影响，例如AEC溶于乙醇和二甲苯需要选择使用水溶性封片剂。
染色后组织切片经过梯度乙醇-二甲苯脱水透明处理，永久封片（如DAB显色）。AEC显色不能按永久性封片归档。
所有实验室应当按照法规要求保存和处理病理样本和试剂耗材。2009年3月6日原卫生部办公厅印发《病理科建设与管理指南（试行）》的第三章第十八条规定：病理切片、蜡块和阳性涂片保存期限为15年。切片应当保存在干燥环境下，防止温度过高。组织包埋蜡块应当储存在有温控的环境中，建议在贮存前对其进行封蜡处理。
现在有半自动或全自动的免疫组织化学染色机可供选择。通常来讲，一台保养良好和校准精确的自动染色机可以优于或等同于手工染色。全自动染色仪的应用将会促进批次间及日间染色流程的标准化，提高染色的一致性及重复性，是发展的必然趋势。
免疫组织化学结果的观察及判读均需要一定的背景知识和专业经验。技术人员必须掌握基本判读原则、常见抗体阳性部位及阳性表达，利于免疫组织化学质控工作的进行。
免疫组织化学的结果判读是以观察染色模式为基础，将观察结果与预期结果进行比对得出的结论。多数染色结果的判读为定性，即阳性（+）或阴性（-）。在某些特殊情况下，如对肿瘤组织中激素受体蛋白、靶向治疗的靶标蛋白、细胞增殖蛋白等进行免疫组织化学检测时，染色结果多采用半定量计数法[11]，一般是染色强度与阳性细胞比例相结合进行判读。个别分子靶向蛋白染色结果也会表示为阳性（+）或阴性（-），如间变性淋巴瘤激酶（ALK，克隆号DF53，Ventana检测平台）的检测。
少数部分抗原表达部位不同，所代表的诊断意义不同，如p120在乳腺小叶癌与导管癌中表达部位不同。
阳性及阴性对照可以确保实验结果的可信性。选用已知阳性或阴性的组织或细胞系作为阳性及阴性对照，与待测组织同时进行相同的染色，并通过比较进行结果判读。任何对照组织染色结果与预期不符时，必须寻找原因后重新染色。（1）阳性内对照：除了在实验中设立阳性或阴性对照外，观察实验切片中自身阳性内对照是非常重要的[12]，例如在细胞角蛋白染色中，观察肿瘤中残余的正常上皮细胞是否阳性。（2）染色部位不正确则视为假阳性：例如膜抗原（如CD20、HER2等）阳性信号出现在胞质或胞核时，应视为假阳性[13]。随着对免疫抗原亚细胞定位的更深入研究，免疫反应的形态也是重要参考依据，如嗜铬素粒A、T细胞胞质内抗原等的染色应呈胞质内的颗粒状，如呈胞质均匀一致的染色效果，则染色结果不可靠。
正常组织抗原表达应考虑到人体发育、生理学及正常的变化。例如：雌激素受体（ER）及孕激素受体（PR）表达随月经周期所处的天数而产生变化。生理的或者检测前（分析前）因素还会影响抗原在细胞的定位。同种抗体的克隆号不同，表达也可能存在差异。Ki-67为核表达，而在脂肪细胞、细支气管肺泡壁Ki-67（克隆号MIB-1）可呈膜性表达。
免疫组织化学的质量控制贯穿于病理科免疫组织化学实验的全流程，其包括室内质控和室间质控。免疫组织化学检测流程中任何一个环节的调整及试剂的更换均应记录在案，有据可查。
设置阳性对照和阴性对照是验证操作步骤是否正确及染色结果是否准确的关键，根据对照染色结果可以判断操作的准确性和试剂的有效性。理想状况是将一个已知的阳性对照和患者的检测样本置于同一张切片上，确保所有试剂同时与患者样本和阳性对照反应，最大限度地保证二者检测条件的一致性。为确保抗原活性，阳性对照片现用现切，不可长时间保存。对于与肿瘤靶向药物治疗相关的检测项目[例如HER2、ER、PR、ALK、CD20、CD117和程序性死亡分子配体1（PD-L1）等]，必须设置对照。其对照的设立应按照国内检测指南/专家共识设置，对于无指南/专家共识的抗体应设立阴性及阳性对照，以确保结果的可靠性。（1）阳性对照：使用已被证明含有靶抗原成分的组织作为外部阳性对照。如果阳性对照无阳性染色或染色强度改变，同批次的检测样本染色结果无效。每批次检测都要有阳性对照。外部阳性对照组织应选择有特征性低水平阳性表达的检测样本。使用低表达的外部阳性对照可以明确由于检测体系的微弱变化而导致的免疫组织化学染色不稳定，强阳性对照可能导致弱阳性表达的组织出现假阴性结果。使用强表达的肿瘤可能导致校准实验结果不准确。细胞系亦可用于实验对照。最理想的对照设置中应包含不同程度表达（强、中、弱）及阴性表达的组织，以保证整个检测体系的正确性。优先选择表达抗原的正常组织作为阳性对照。某些抗原在正常组织中很少表达，或在正常组织中弥漫性表达（黑色素细胞和卵巢细胞），或正常组织类型难以获得表达，对于这些情况，可以使用已被证实阳性表达的肿瘤组织用作外部对照。2015年国际特设专家委员会推荐18种病理诊断常用抗体对照组织及染色结果的判读标准[14]。各单位可以根据本单位情况确定自己的免疫组织化学阳性对照组织。已知的阳性对照组织是为了组织处理过程和实验试剂有效性的质控，不能作为患者样本特异性诊断的标准。如果已知的阳性对照染色失败，则样本检测无效。（2）阴性对照：包括特异性和非特异性阴性对照2类。特异性阴性对照包括阴性试剂和阴性组织对照。临床上较为常用的是特异性阴性组织对照。阴性对照无特异性表达证明无交叉反应出现。如果特异性着色（假阳性）出现在阴性对照组织中，患者样本检测结果认定为无效。阴性试剂对照实验包括除了特异性一抗以外的所有过程（如抗原修复、封闭、孵育及检测系统）。理想的替代试剂是含有除特异性一抗外的所有其余成分，且与一抗生产过程相同，对人体组织不产生特异性反应。孵育时间与一抗一致。待检组织中染色强度的观察应在阴性试剂对照无非特异性染色的情况下评估。阴性结果意味着未检测到抗原，而非细胞或组织中不存在该抗原。（3）组织内对照：最佳阳性内对照是待检样本中特征性表达靶抗原的正常细胞，其与待检组织具有相同的前处理条件。不是所有的标记都具有合适的或可获得的组织内对照。正常组织抗原的表达会因生理变化而发生变化，从而限制选择其作为内对照。组织内对照如出现假阳性染色或假阴性染色均表明实验失败。
目前许多医院开始应用全自动/半自动免疫组织化学仪进行免疫组织化学检测，相应的仪器设备应纳入质控范围。设备涉及的所有因素（试剂、仪器维护等）均应质控，并记录相关内容。
定期参加室间质控是保证实验室检测准确性的重要手段之一。实验室可以根据本单位实际情况定期参加不同的室间质控。
本共识从组织处理、检测步骤及注意事项、结果判读、质量控制等对免疫组织化学检测全流程进行了系统描述。从实际出发，力求简捷，具有可操作性、指导性和前瞻性，为推进免疫组织化学检测的标准化、规范化进程奠定基础。
《免疫组织化学检测技术共识》编写组成员（以单位拼音顺序排列）：北京大学医学部病理学系（张波、张燕）、北京大学肿瘤医院病理科（林冬梅、周立新）、中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科（陈杰、李星奇、庞钧译）、北京中杉金桥生物技术有限公司（潘越宁）、解放军总医院病理科（宋欣、石怀银）、解放军总医院第七医学中心病理科（田玉旺）、首都医科大学附属北京安贞医院病理科（王伟）、首都医科大学附属北京世纪坛医院病理科（高颖）
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
