乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene，BRCA)是重要的抑癌基因，包括BRCA1和BRCA2[1,2]。BRCA1/2基因是评估乳腺癌、卵巢癌和其他相关癌症发病风险的重要生物标志物，也是影响患者个体化治疗方案选择的生物标志物，所以BRCA检测具有重要的临床意义。BRCA基因检测难度较大，没有热点变异，变异遍布于2个基因的全长[3,4]。国内对于BRCA基因检测一般采用下一代测序(next generation sequencing, NGS)的方法，但目前尚无统一的检测流程与标准。为建立基于NGS技术的BRCA基因检测的方法学标准以及规范临床检测操作，中华医学会病理学分会特组织国内分子病理学领域的相关专家，对BRCA基因检测流程进行讨论并达成共识。
BRCA1/2通过同源重组修复(homologous recombination repair)途径对DNA双链断裂进行修复，若BRCA基因突变导致BRCA蛋白功能缺陷，会影响基因组的稳定性，并引起多种癌症的发生[3]。约5%～10%的乳腺癌和15%～22%的卵巢癌是由BRCA1/2基因突变导致的[5,6]。BRCA1/2基因致病性突变，使女性发生乳腺癌风险提高5倍，发生卵巢癌风险提高10～30倍[7,8,9]。一项研究结果表明，在美国普通女性人群中，70岁以下患者只有11%的概率死于乳腺癌或卵巢癌，而BRCA1/2基因致病突变携带者死于这2种癌症的概率达56%～72%[10]。所以，携带BRCA基因致病突变不仅增加了女性罹患乳腺癌和卵巢癌的风险，也极大地提高了女性死于这2种癌症的比例。了解BRCA基因状态，也有助于进行相关的遗传管理，包括采取预防性手术、评估家属遗传风险等，BRCA基因致病性突变携带者若在合适时机采取预防性手术可大大降低患癌风险[11,12]。
铂类化疗药物通过引起DNA损伤破坏基因组稳定性，引起细胞死亡，被广泛应用于临床一线治疗各种癌症，包括卵巢癌和乳腺癌等。BRCA基因突变的癌细胞存在同源重组修复缺陷，影响DNA双链断裂修复过程，导致癌细胞对于诱导DNA双链断裂的化疗药物极为敏感[13]。已有多项研究中表明，携带BRCA基因致病性突变的卵巢癌患者在接受铂类治疗后获益更显著，具有更好的总生存率(OS)和无进展生存率(PFS)[14,15]；也有研究表明，三阴性乳腺癌患者若携带BRCA基因致病性突变，对铂类化疗有着更好的响应[16]。
相比传统化疗，靶向治疗有着更显著的优势，针对性强，副作用小。对合适的患者使用合适的治疗，可以显著延长患者生存期，提高患者生存质量。PARP1是一种在修复单链DNA断裂过程中至关重要的酶，在存在BRCA基因致病突变的肿瘤细胞中，BRCA1/2介导的DNA修复途径发生缺陷，当PARP介导的DNA修复途径也被抑制后，DNA断裂得不到修复，DNA损伤积累，导致细胞凋亡，即合成致死效应[17]。已有文献报道，携带BRCA基因致病突变的乳腺癌患者接受PARP抑制剂类药物治疗相比传统化疗，中位无进展生存期延长2.8个月，疾病或进展风险降低42%[18]；对于铂敏感的卵巢癌复发患者，虽然无论是否携带BRCA基因致病性突变都获益于PARP抑制剂类药物的治疗方案，但是携带BRCA基因致病性突变的患者获益更大[19,20,21,22]。
预后是临床上用以判断患者治疗结局的重要因素，需要考虑多种疾病状态和相关指标。对于卵巢癌患者来讲，BRCA基因突变状态是一个指示患者预后的重要因子。有研究报道，携带BRCA基因致病性突变的卵巢癌患者相对于BRCA基因野生型的患者有着更好的预后[23]。而对于乳腺癌患者，从目前的研究中尚不能得到一致的结论[24,25]，因此对于BRCA基因状态是否与乳腺癌患者预后直接相关仍需要更多的研究证据。
综上，BRCA基因检测可以有助于评估相关肿瘤的遗传易感性，制定相应的遗传管理措施(包括采取预防性手术、评估家属遗传风险等)，还可以协助制定精准诊疗方案以及判断癌症患者的预后等。
新近的国内外权威指南和专家共识均推荐符合一定条件的乳腺癌/卵巢癌等患者及癌症高风险人群进行BRCA基因突变检测。《美国国立综合癌症网络(NCCN)关于乳腺癌和卵巢癌的遗传性/家族性高风险评估指南Version 1.2018》推荐所有家系中发生过致病性BRCA基因突变的个体、所有卵巢癌(包括输卵管癌及原发性腹膜癌)患者以及满足特定条件的乳腺癌等其他癌症患者(如年龄不超过45岁的乳腺癌患者、年龄不超过60岁的三阴性乳腺癌患者、男性乳腺癌患者等)进行BRCA基因检测[26]；《NCCN乳腺癌临床实践指南Version 1.2018》强烈推荐适合单药治疗的HER2阴性乳腺癌患者进行胚系BRCA基因检测[27]；《NCCN卵巢癌临床实践指南Version 2.2018》推荐所有复发的卵巢癌、输卵管癌或原发性腹膜癌患者，在开始治疗前进行肿瘤分子检测(包括BRCA1/2基因)；《卵巢上皮性癌BRCA基因检测的中国专家讨论》建议"在中国卵巢癌人群中进行BRCA基因检测，并建立中国人群的研究数据库"并建议"卵巢癌患者在确诊时进行BRCA1和BRCA2基因检测"[28]；《中国晚期乳腺癌临床诊疗专家共识2016》中指出"对三阴性晚期乳腺癌，特别是年轻患者，建议行BRCA基因突变检测"[29]；《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2017年版)》中推荐"对发病年龄小于等于40岁的三阴性乳腺癌患者应考虑进行BRCA1/2基因突变的检测"[30]。
结合这些权威共识和指南，本共识建议HER2阴性晚期乳腺癌患者和所有新确诊以及复发的卵巢癌患者进行BRCA基因检测；对于铂敏感复发的卵巢癌患者，无论是否携带BRCA致病突变都可获益于PARP抑制剂治疗[19]，若需评估遗传风险，可行胚系BRCA基因检测，但在检测前需要专业人士进行遗传咨询工作；肿瘤BRCA基因检测无需遗传咨询。
进行BRCA基因检测的实验室必须通过相关机构认证，有严格的实验室标准操作流程(SOP)，并定期参加国际和国内相关室间质评项目(EQA)[如欧洲分子遗传实验质控网(EMQN)及国家卫生计生委病理质控评价中心(PQCC)的质控项目]对其检测能力进行评估[31,32]。
BRCA检测涉及的人员包括检测人员、生信分析人员及变异解读人员等，相关的人员必须接受过技术检测、生信分析或突变解读相关的专业培训，并获得相应的资格证书[31]。对于检测过程的操作人员必须经过质量管理体系、操作规程、污染防控等技能的培训，并严格按照SOP操作，确保检测结果的准确可靠。生信分析及变异解读人员应具有生物信息学或者遗传学专业背景，并接受过基因检测相关培训[31]。变异解读人员应具有遗传咨询师资质或经相关遗传咨询培训合格。
基于NGS检测BRCA基因突变的流程可以概括为以下六个环节(图1)，即样本获取及处理、核酸抽提、文库构建、上机测序、下机数据分析以及变异解读，每个环节都应包括相应的质控步骤。
目前针对BRCA基因检测分为胚系BRCA基因检测和肿瘤BRCA基因检测，需根据患者的具体情况确定进行何种检测。建议对于可获取肿瘤组织的癌症患者，可进行肿瘤组织样本检测，一般使用手术或穿刺获得的肿瘤样本；对于肿瘤组织不可获取的癌症患者和癌症高风险人群，可进行胚系BRCA基因检测，一般使用血液、唾液、口腔拭子等样本，目前以血液为主。对样本的要求如下：
恶性肿瘤细胞占比≥20%；手术样本(大样本)：≥50 mg(黄豆大小)；穿刺样本(小样本)：至少1针。
恶性肿瘤细胞占比≥20%。为保证FFPE标本DNA提取的成功率，请尽可能送检1年以内的蜡块或6周以内的石蜡切片，切片厚度4～5 μm(防脱玻片)；手术样本(大样本)：≥5张；穿刺样本(小样本)：≥10张。
采集5 mL全血，保存于EDTA抗凝管中，常温(15～35 ℃)运输至检测实验室，建议2 h内处理，全过程注意防溶血。
收集2 mL唾液样本，注意避免产生过多气泡，收集后与保存液混合均匀，常温保存和运输，及时提取DNA。
检测对象温开水漱口后，用无菌棉签在颊黏膜清擦10次，直接用于DNA提取或者干燥后常温暂时保存1个月，常温运输。
原则上优先采用由国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准上市的试剂盒进行基因组DNA提取。提取DNA后的剩余样本一般建议长期保存或保留至产生报告结果时按流程销毁。针对不同的样本类型，需选用不同的DNA提取方法和试剂。
DNA的质量和浓度对检测结果的准确性有重要影响，所以对DNA的质量控制环节不容忽视。需要从DNA纯度、浓度以及片段化程度进行充分评估，在进行浓度和纯度测定时，可采用Nanodrop和Qubit仪器。采用琼脂糖凝胶电泳等方法对片段化程度进行评估。剩余DNA建议永久归档或至少保留至产生报告时。
目前，国内对于BRCA基因检测一般采用NGS方法，测序前需要对DNA样品进行文库制备。可使用2种方法对DNA样本进行文库制备，即基于扩增子的方法和基于杂交捕获的方法。选择合适的文库制备试剂盒，需考虑适用样本、DNA起始量、基因板(gene panel)数据量等因素。另外，检测区域需至少包括BRCA整个外显子编码区及外显子与内含子交界区(＋/－20个碱基对)。
该方法通过严格的引物设计和优化的PCR反应条件，使得PCR反应可以在多重环境下得以进行而不互相干扰。目标区域经过扩增后，富集产物通过连接法加上接头变成可以测序的文库。
该方法在全基因组的建库基础上再通过探针捕获富集目标文库。对于全基因组文库的建立基本上包括了2大类方法，接头连接酶法和转座酶接头导入法。通过这2类方法获得的全基因组文库再与生物素标记的基因组目标区域探针进行杂交，杂交产物通过亲和素磁珠富集含有目标区域片段的文库用于上机测序。
为使测序质量和产量达到最优，需要从DNA浓度及片段大小等方面对文库制备过程进行质控，文库定量一般采用Qubit，也可采用qPCR方法，对片段大小进行分析可采用Bioanalyzer 2100。确定文库可用后即可进行后续的上机测序。
胚系BRCA基因检测和肿瘤BRCA基因检测对NGS检测的测序深度和质量要求不同。胚系BRCA基因检测只需检测杂合突变或纯合突变，理论突变频率分别为50%或100%，而肿瘤组织BRCA突变频率可能很低。此外，使用不同的测序平台、选用不同的文库构建方法，对测序深度也有不同的要求，推荐测序深度请见表1。
测序深度推荐
测序深度推荐
| 文库构建方法 | 胚系BRCA | 肿瘤BRCA |
|---|---|---|
| 基于扩增 | 100×(最低测序深度) | 1 000×(平均测序深度) |
| 基于捕获(去冗余后) | 30×(最低测序深度) | 500×(平均测序深度) |
测序完成后，需对原始测序数据进行质控，一般参考Q30值。
完整的BRCA基因检测，除了包括对点突变和小片段插入缺失的检测，还应包括对大片段重排的检测，据已有报道，大片段重排占致病突变的比例在不同人群中会有所不同，约为0～40%[33]。多重连接探针扩增技术(MLPA)是目前应用最广泛的大片段重排检测方法，在未检测到致病点突变或小片段插入缺失时，一般需要检测是否存在大片段基因重排。此外，部分经过特殊设计并严格验证的NGS方法在检测突变的同时也可以检测大片段基因重排。
在获得原始测序数据并进行质控后，常规的分析流程主要包括数据比对、变异识别、变异注释等，数据分析流程中常用软件可参考表2。
在测序原始数据完成比对之后，需再次进行质控，质控内容包括检查测序深度是否达到最低或平均测序深度要求(表1)，此外，还需参考测序片段比对率和覆盖率等参数，目前对这2项没有统一的最低值，但建议利用IGV等软件对变异位点进行可视化查看和确认。
变异解读是BRCA基因检测结果分析中的关键步骤，为临床报告提供重要参考依据。变异分类建议参考国际癌症研究机构(IARC)分类，根据变异的致病性可分为五类：5类-致病性、4类-可能致病性、3类-意义未明、2类-可能良性以及1类-良性[37]。数据解读的标准和规范以及数据解读和注释流程中常用数据库可参考《ACMG和美国分子病理学会(Association for Molecular Pathology，AMP)序列变异解读标准和指南(2015版)》《美国分子病理学会(AMP)/美国临床肿瘤学会(ASCO)/美国病理学家协会(CAP)癌症序列变异解读和报告的标准和指南(2017版)》以及《BRCA数据解读中国专家共识》[34,36,38]。BRCA基因检测报告可参考《BRCA数据解读中国专家共识》[36]。
对BRCA检测适用人群进行肿瘤组织样本、血液或其他样本的BRCA基因检测，当检测结果(点突变、小片段插入缺失)阴性时，推荐进行大片段重排检测；肿瘤组织检测阳性时，应进一步验证是否为胚系BRCA基因突变[26]，以便于制定相应的遗传管理措施；另外，建议在胚系BRCA基因检测前由专业人员对受检者提供遗传咨询(图2)。
注：a使用MLPA方法对大片段重排的检测以血液为主要样本，若用特殊设计的NGS检测出存在大片段重排，一般需要再用PCR方法进行验证；b肿瘤检测阳性时，应进一步验证是否为胚系BRCA基因突变，以进行遗传管理，为家族成员提供指导
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