液相色谱－质谱(LC－MS)技术在临床诊断治疗领域的应用日益广泛，为了使LC－MS技术在临床诊疗中规范应用，中华医学会检验医学分会、卫生计生委临床检验中心共同制定《液相色谱－质谱临床应用建议》，并由复旦大学附属中山医院检验科执笔起草，广泛征求相关领域检验专家的意见。
本应用建议最后经中华医学会检验医学分会和卫生计生委临床检验中心组织专家进行讨论修改后，由中华医学会检验医学分会、卫生计生委临床检验中心和《中华检验医学杂志》编辑部共同发布。由于医学科学技术发展迅速，本应用建议将适时修订，以适应医学发展和临床应用的需要。本文直接使用的缩略语见表1。
本文直接使用的缩略语
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| 缩略语 | 全拼 | 中文解释 |
|---|---|---|
| APCI | atmospheric－pressure chemical ionization | 大气压化学电离 |
| APPI | atmospheric－pressure photoionization | 大气压光电离 |
| CV | coefficient of variation | 变异系数 |
| CRMs | certified reference materials | 有证参考物质 |
| ESI | electrospray Ionization | 电喷雾电离 |
| EQA | external quality assessment | 室间质量评价 |
| HPLC | high－performance liquid chromatography | 高效液相色谱 |
| IS | internal standard | 内标 |
| LC | liquid chromatography | 液相色谱 |
| LC－MS | liquid chromatography－mass spectrometry | 液相色谱－质谱 |
| LLMI | lower limit of measuring interval | 定量检测下限 |
| LoD | limit of detection | 检测限 |
| MRM | multiple reaction monitoring | 多重反应监测 |
| MS | mass spectrometer | 质谱 |
| QA | quality assurance | 质量保证 |
| QC | quality control | 质量控制 |
| RP | reverse phase | 反相 |
| S/N | signal/noise | 信噪比 |
| SPE | solid－phase extract | 固相萃取 |
| SRM | selected reaction monitoring | 选择反应监测 |
| ULMI | upper limit of measuring interval | 定量检测上限 |
| TEa | allow total error | 允许总误差 |
LC－MS是一种联合液相色谱和质谱分析的检测技术，结合了色谱对物质的高分离能力和质谱对物质结构和质量的分析能力，具有高选择性、高特异性以及高灵敏度的特点。与免疫方法相比，LC－MS更适合用于小分子化合物的定性、定量检测(如激素、药物及其代谢产物、维生素、氨基酸等)。LC－MS不仅在临床检测中发挥优势，更有助于开发临床检测项目的参考方法。随着易用性和自动化程度不断提高，LC－MS会成为临床检验技术重要的一部分。
本应用建议旨在为定量LC－MS方法的临床检测提供基本指导原则，主要包括两部分：LC－MS检测的基本要求和LC－MS方法的建立、验证和执行。
实验室应根据不同仪器厂商的要求，提供足够的工作空间，建议预留出仪器和辅助设备装载空间以及操作和数据处理工作空间。实验室应确保质谱仪的两侧有足够的空间放置色谱仪和废液瓶。机械泵建议装载于仪器附近下方并高于地面，周围留有足够的空间便于散热和保养维修。仪器四周应留出适当空间便于日常操作、定期维护保养和检修。仪器不适于直接安装于空调下方或阳光直射处。仪器安装应符合安全操作要求。实验室应确保仪器在充分通风、温湿度严格控制的环境下运行。仪器附近应避免存在干扰检测的震动、磁场和射频辐射源。
若实验室无中心供气设备，还需要预留出供气瓶空间或气体发生器的空间和废气排放管路并符合安全操作要求。
为保证仪器检测性能的稳定和可靠，建议使用具有稳压的连续不间断电源，安装要求应参照各个仪器的具体参数。
除了仪器基本的配置外，实验室还需配置储存样品及标准品的冰箱或冷库及样品前处理工作区域。
实验室建议使用MS级去离子水要求的纯水制备仪或直接购买MS级别的纯水以供使用。
建议1 实验室环境需根据LC－MS仪器厂商的具体安装要求，提供足够的工作空间，严格控制温湿度，供气、供电以及供水符合要求等，进行科学规划、装修和调整。
依据《中华人民共和国卫生行业标准－临床实验室安全准则》、《中华人民共和国国家标准实验室生物安全通用要求》和《危险化学品安全管理条例》等相关文件，实验室应制定适当的安全防护措施[1]。实验室操作人员在实验区内需穿着遮盖前身的长袖隔离服或长袖长身的工作服，佩戴手套，必要时佩戴其他防护装备(如护目镜、帽子或面罩等)。为保证操作人员安全，生物样本处理需要在二级生物标准实验室或通风橱操作进行。实验室必须安装安全冲淋设施和洗眼器。化学危险品应贴有成分标签，按照说明要求按类储存，双人双锁。常用的易燃有机溶剂应保存于箱柜内，氮气或其他气体瓶要有固定装置以防倾倒泄漏。化学危险品的申购、领取、保存、使用和处理需做好相应记录。应依据《医疗废物管理条例》、《医疗卫生机构医疗废物管理办法》等法规，结合各实验室的实际情况，制定对操作过程中产生的气体、液体和固体危险废弃物的收集、存放和处理的细则，做好气体排泄的安全工作。为保证实验室安全，建议定期对实验室进行安全检查。
建议2 实验室需按照国家、地方颁布的法规或条例，制定全面、适用的安全防护规章制度，保证人员、环境和标本的安全。应有气体、液体和固体危险废弃物的收集、存放和处理实施细则，制定化学危险品试剂存储和使用要求，做好人员防护工作。
实验室主任应确保开发和使用的检测系统提供了保证质量的实验室服务，确保实验室具备完善的设备设施和环境条件以及符合生物安全法规要求。实验室主任对操作人员进行规范化操作教育和培训。
建议配备生物化学、分析化学或临床检验等相关教育背景和工作经历的研发人员和经过培训的操作人员。操作人员在上岗前，需经系统性的理论和操作培训，并通过相应的技能考核，证明具备与工作相关的理论知识和操作能力。初学人员，建议在有经验人员的指导下完成相关操作。
实验室制定操作人员培训计划，包括实验室内部及外部培训。培训记录证明相应实验操作人员通过培训考核。实验室建立每一位操作人员的档案记录，包括员工的简历、教育背景、工作经验、培训考评记录等。
建议3 实验室主任应确保实验室检测性能良好、设备环境完善、生物安全合规以及人员培训、操作规范。研发人员应具备生物化学、分析化学或检验医学等相关的教育背景和工作经历。操作人员应经培训、考核后才能上岗操作。
LC－MS检测系统由LC、进样接口、离子源、质量分析器、检测器、数据处理器等组成。其中定量分析多用三重四级杆、离子阱、飞行时间质量分析器。
选择LC－MS系统时应综合考虑预期工作用途、检测灵敏度、分析通量、稳定性以及系统成本等因素[2]。
LC是基于混合物中不同分析物在固定相和流动相间分配平衡的分离技术。高效液相色谱技术有极高的分离性能和良好的重现性等特点，常作为质谱搭配使用的首选。
目前临床质谱仪常用的三种离子源分别为ESI、APCI和APPI，其特征如表2所示[3]。
三种临床常用质谱离子源的特点
三种临床常用质谱离子源的特点
| 离子源 | 主要优点 | 主要缺点 | |
|---|---|---|---|
| ESI | 在临床应用中具有广泛的适用性对极性分析物的电离效果好产生多种带电离子能够分析大分子(相对分子质量>1 000) | 较APCI更易受基质效应影响 | |
| APCI | 与ESI相比，不易受基质效应的影响对弱极性分析物的电离效果好 | 通常仅能形成单电荷离子，有效质量范围受限不适用于热不稳定分析物 | |
| APPI | 对非极性分析物的电离效果较好 | ||
| 无法用ESI或APCI电离时的备选方法 | 临床适用范围有限 | ||
质量分析器是质谱仪的重要组成部件，位于离子源和检测器之间，依据带电离子质荷比(m/z)检测分析物。常见的质量分析器包括四极杆质量分析器、飞行时间质量分析器、离子阱质量分析器和混合串联质量分析器。单四极杆质谱仪内置有质量分析器，该分析器只能测定仪器离子源中形成的离子，可提供的结构信息较为有限。串联四极杆(有时称为三重四极杆)质谱仪内有两个被碰撞室分开的四极杆质量分析器。质量分析器检测模式包括全扫描、子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描以及MRM等。三重四极杆质量分析器是临床定量检测最为常用的质量分析器。
建议4 选择LC－MS系统时应综合考虑分析类型、检测灵敏度、分析通量、稳定性以及成本等因素。
目标分析物在体内存在的形式决定了检测选取的样本类型。临床常见的样本类型包括全血、血清、血浆、尿液及唾液等，例如对易结合于红细胞内的分析物(如环孢素A、他克莫司、西罗莫司等)，推荐采用全血样本检测；在毒理学检测中常用尿液样本。
需考虑某些血液成分的检测结果易受到采血体位的影响，例如检测某些血压相关激素及其代谢产物(醛固酮、儿茶酚胺等)时，采血体位变化易导致结果的差异，需根据体位建立相应的参考区间。
对外源性和内源性分析物，都要考虑采集时间。治疗药物、毒物、补充剂等外源性化合物，应根据其药物代谢动力学特性选择恰当的采集时间，例如在治疗药物监测中，环孢素A、他克莫司等药物的峰值或给药前浓度能反映药物在体内水平，而服用1，4－丁二醇二甲磺酸酯、霉酚酸患者需检测多点药物浓度，通过药物曲线下面积确定给药策略。激素等内源性化合物水平随生理周期、性别和年龄而发生规律性变化，如孕酮等存在生理周期变化、皮质醇等具有昼夜节律变化等，应根据激素的变化规律选择采集时间。
应考虑样本采集的设备和容器对检测的影响，例如在样本采集过程中使用了不恰当的采样针可能导致血细胞破碎，引起溶血，影响检测结果。
对样本在运输过程中的全程监控也很重要，避免运输不当造成对检测的影响。
导致化合物不稳定的因素主要有物理因素和化学因素。物理因素包括光照和温度，化学因素与分析物的化学结构有关。正确的样本处理方式有利于保证生物样本稳定性。分析前样本的稳定性对生物分析数据有效具有重要意义。
建议5 应充分考虑样本类型、采血体位、采集、运输、处理、储存等因素对检测结果的影响。
IS指不同于目标分析物的已知质量的纯品物质，主要用于LC－MS定量分析中校正基质效应或样本萃取、色谱分离、离子化过程中产生的偏差[3]，有利于提高定量分析的准确性和精密度及方法稳定性。
IS应选择不存在样本中的非内源性物质，应具有与目标分析物相似的理化特征和相似的色谱保留时间，应避免IS中存在与目标分析物在色谱中可以共同洗脱且具有相同质量数的干扰物，其浓度不能干扰分析物的LLMI的检测。
IS一般有两种，即结构类似物和稳定同位素标记物。目标分析物和结构类似物IS之间不应发生质谱峰重叠现象。推荐使用非放射性稳定同位素标记物，因其具有不易转化为非标记物质的特点，并能满足作为IS的稳定性及安全性的要求，使分析结果具有更好的精密度和准确性。检测中建议IS的相对分子质量比目标分析物至少大3，标记纯度超过98%[3]。目前，商品化同位素标记的IS包括2H、13C、15N、18O或混合标记，不推荐使用放射性较强的标记，如125I、3H和14C；推荐使用13C、15N标记。
IS的浓度会影响LC－MS的线性、精密度和准确性，其浓度的选择要适当。
IS的加入顺序十分重要。一般推荐IS在处理前加入样本中，以校正样品前处理过程中分析物的损失；对于需预酶解的样本，如果IS是酶解后目标化合物的类似物，建议在酶解后掺入。由于内源性物质干扰，标准曲线所用的基质和样本有差异时，同位素IS应该作为第一选择用于校正不同基质分析物离子化的差异。
在检测分析过程中，应监测IS响应波动的程度。
建议6 推荐采用稳定非放射性标记物作为IS，选择适当的浓度和加入顺序，并监测IS响应波动的程度。
LC－MS技术灵敏度高，可达到皮克级，故容易受到试剂纯度或耗材杂质的干扰，需关注检测过程中试剂和耗材对检测的影响。
试剂中的杂质会导致离子抑制，影响检测结果，因此有机试剂的纯度选择极为重要，需要评估该试剂是否会产生离子抑制。建议挑选MS级别的试剂，使用前需做好验证工作，使用期间按照说明书恰当保存，操作过程必须避免污染，防止高温和挥发对其稳定性、浓度和纯度的影响。
样本采集和预处理过程中，样本采集管、塑料吸头、离心管和微量滴定板等耗材内析出的杂质会影响分析物检测结果，产生干扰峰或背景噪音，例如有报道表明，普通的血清分离管的杂质会影响睾酮检测结果，某些聚丙烯离心管对25－羟基维生素D检测结果也会产生影响。同一厂商的不同批次的耗材，因生产流程或材料来源改变，也可能干扰最终的检测结果。新色谱柱及管路在使用前建议适当平衡以去除制造过程中残留的杂质。
在标准品和IS制备时，实验室需配备A级的容量瓶和移液器。使用前需评估和记录容量瓶、移液器的准确性和精密度[4]。
建议记录样本制备使用的试剂、色谱柱以及其他耗材的批号，以便追溯干扰源。
建议7 关注检测过程中试剂和耗材对检测结果的影响，记录每个试剂、色谱柱、耗材的批号以便追溯干扰源。
LC－MS的实验室质量管理体系包括质量保证和质量控制，必须涉及整个检测流程，即从预处理、样本检测到结果解释。完善的质量管理体系有利于保证检测系统的稳定性和可靠性。为监测每个操作步骤，应要求质控品与样本的操作步骤基本一致。质控品的选择需注意基质与检测样本相似、稳定且均一。
建议尽量检测3个浓度质控样本。质控样本浓度尽可能覆盖定量范围，包括三倍LLMI、定量范围的中间以及ULMI的附近，也可设定在LLMI或者医学决定水平附近。
建议在每批次检测前、后均运行质控样本。质控频率取决于方法学性能、某一时间段内检测的样本数量以及错误结果对于临床影响的严重程度。如果方法很稳定可以减少质控的频率；反之，如果方法存在性能下降的情况，需要增加质控频率。
无论商品化或自配质控样本，实验室必须建立质控的可接受标准。对于商品化质控样本，生产商提供的可接受范围不能直接使用。定量项目建议使用质控图和质控规则。
无论商品化或自配质控样本，质控的基质尽量和患者样本基质一致。对于无成品或商品化质控品(自制质控品)应由该专业具有丰富工作经验操作人员配制，并采用盲法按照性能要求进行评价。
通过参加EQA评价实验室检测能力，对能力比对结果进行分析总结，关注比对结果是否产生趋势或偏移。
对于无EQA的检测项目，建议与外部实验室相同或相近的方法比对，需考虑两种方法的检测性能，包括样本、可接受范围和定量检测限等。
建议8 尽量检测3个浓度质控样本，质控品浓度尽可能覆盖定量范围，包括三倍LLMI、定量范围的中间以及定量上限的附近，建议每批次样本检测前、后均运行质控样本。
建议9 通过参加EQA评估实验室检测能力。对没有EQA的检测项目，建议与外部实验室比对。
对于LC－MS检测方法，通过额外的质量保证和质量控制的方式，确保色谱和质谱条件均处于正常检测状态。
推荐至少在每个分析批次之前、预防性维护之后、仪器卸真空后或者是当系统平衡出现问题的时候进行系统适用性测试，以确保检测系统处于正常状态。检测系统适用性样本用于测试系统适用性的参数有噪音、分析物信号、保留时间、色谱峰分离度和色谱峰对称性。
仪器设备重大维修、维护保养后，例如质谱仪四极杆、质谱仪机械泵、检测器更换等，需评估仪器维修、维护保养后的性能指标与维修、维护前保持一致，还需评估故障前后临床样本检测结果的偏移程度。
建议周期性回顾方法学验证，回顾内容有精密度、准确性、携带污染等。
建议10 至少在每个分析批次之前、预防性维护之后、仪器卸真空后以及系统平衡出现问题的时候进行系统适用性测试。
建议11 对LC－MS进行周期性质量监控，包括仪器性能和方法学回顾。
分析前应通过文献检索评估目标分析物现有检测方法的局限性以及选择LC－MS检测的必要性。根据目标分析物的理化性质和分子结构选择合适的样本类型并建立分析方法[2,3]。
在分析方法的开发过程中，首先，我们可根据目标分析物的官能团、已发表的文献、实验设计选择仪器检测极性，即正或负离子模式。酸性化合物会形成负离子，而碱性化合物倾向于形成正离子。有些目标分析物会同时形成正离子和负离子。在这种情况下，选择何种仪器检测极性取决于是否能够达到可接受的灵敏度和重现性。
其次，制备高浓度的纯品分析物，以制造商推荐的流速用注射器连续进样，对目标分析物进行全扫描。观察第一级四极杆的质谱图，确定母离子以及相应的质荷比。母离子的质量数取决于是否形成加合物。
第三，确定子离子及母离子/子离子对。需用注射器直接进样，锁定母离子后扫描子离子。一般应避免选择损失质量数为18的碎片离子，因其在基质中的背景噪音偏高。
第四，优化质谱仪各项参数：包括离子源参数以及质谱扫描参数，以获得最佳的离子对响应值。
通过快速筛选不同的母离子/子离子对，分析人员可在单次分析中监测多个SRM离子通道，即MRM。LC－MS定量分析推荐一个分析物使用2个SRM离子通道，分别作为定量离子通道和定性离子通道。需要注意的是在任何给定时间内(例如，通过单次进样监测多种分析物时)监测到的离子对通道越多，单个色谱峰可采集到的数据点就越少，如果用于表征色谱峰面积的数据点数量不足，数据的可靠性可能会受到影响。
优化离子通道内延迟时间，以避免碎片离子之间发生交叉干扰。初步确定碰撞池电压和碰撞池压力后，建议使用提取样本进样以获得基质样本中最佳碰撞电压和S/N的碎片离子。
色谱柱种类繁杂，包括通用型的色谱柱，如RP疏水性色谱柱(如C4、C8、C18、苯基、苯基－己基等)，及用于强极性化合物分离的亲水性色谱柱(HILIC、T3、Amide等)。色谱柱选择通常取决于目标分析物的元素组成和化学结构，需通过查阅文献找到适用于特定待测物的色谱柱。
建议操作人员研读每根色谱柱厂家提供的特征参数以及特定色谱柱的应用和所发表的参考文献。每根色谱柱都有其应用寿命期限，关注其保留时间、峰高、峰宽和分离度的变化以提示色谱柱的更换并填写相关记录表。
流动相是指用于输送待测物通过色谱柱的溶剂。流动相的制备方法一般是向一种或多种溶剂中添加酸、缓冲物质和离子对试剂。大多定量LC－MS方法常用反相色谱，通常流动相(水/有机溶剂)极性较强，固定相(烷基键)极性较弱，常用溶剂包括水、乙腈、甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃等。
影响RP分离效果的流动相参数包括强溶剂百分比、液相流速、溶剂类型、离子强度、pH值、添加剂和温度等。流动相的成分及浓度取决于目标分析物的理化性质和色谱柱的特性。操作人员需研读相关资料了解色谱柱的相关具体信息。
在方法建立过程中，若需提高化合物的分离度，则建议降低强溶剂的比例；若需改善峰形和提高质子化程度，建议使用甲酸－甲酸盐缓冲液、乙酸－乙酸盐缓冲液、氢氧化铵－乙酸盐或氢氧化铵－碳酸盐缓冲液等添加剂。同时应避免使用的添加剂类型包括：非挥发性盐(会导致仪器需要频繁清洗且影响信号强度)、无机酸(腐蚀LC－MS离子源)和表面活性剂(抑制电喷雾)。需注意的是，离子对试剂会影响后续的离子化效果，因此建议尽量不用或使用极低浓度(<0.02%)的离子对试剂。
为获得良好的色谱图，需优化保留时间，建议单个色谱峰包含15～20或至少10个数据点。
LC－MS对分子具有高选择性，但进样前仍需对样本进一步纯化或浓缩。样本预处理方式取决于目标分析物和干扰物的性质。
临床常见的预处理方法包括：蛋白沉淀、液液萃取、SPE和免疫捕获等。蛋白沉淀是直接去除临床样本中大分子蛋白的粗略分离方法。液液萃取是基于分析物在两种不同溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目的，分析物的分配系数影响溶解度和提取回收率。SPE用于痕量分析，选择性分离和浓缩样本中已知的目标分析物。
建议12 LC－MS方法建立之前应考虑目标分析物现有检测方法的局限性以及进行LC－MS检测的必要性。建立和优化每个环节的调整最终将影响到整个检测系统的性能(灵敏度和特异性等)，应当根据检验项目的分析要求和目标分析物属性，对液相色谱和质谱的系统参数进行优化。
建议13 样本预处理之前，根据分析物的理化性质，选择适合的储存容器和处理条件(是否需要低温、避光)，以确保后续检测准确可靠。根据目标分析物和干扰物的性质，选择合适的样本预处理方式。
为定量检测样本内分析物，需要建立已知浓度分析物与目标分析物响应值(峰面积、峰高、分析物与IS的峰面积或峰高比)之间的函数关系。
建议实验室购买和使用商品化的标准品，如无法获得商品化标准品则可以自行配制。标准品可以选择纯度高的纯品用于标准曲线的建立或选择CRMs作为配制标准品的参考物质。由于CRMs的赋值可溯源至参考方法，可用于评估方法的准确性。
标准品和基质尽可能同临床样本相似。对外源性分析物，不含分析物的生物体液可作为最佳的标准品基质。对于内源性分析物，推荐使用"模拟"基质减少基质效应。使用透析法、活性炭处理的临床样本可作为"模拟"基质，若处理后分析物残留仍>20% LLMI，需要使用人工合成基质。标准品使用前建议评估其纯度、稳定性、加样回收率和基质效应
在临床实践过程中，分析检测范围需取决于临床需求。标准品的浓度范围和数量主要取决于定量范围和临床决定水平。建议检测至少6个浓度水平的标准品建立标准曲线，同时检测双空白样本(不含IS和空白含内标样本)确保准确性和精密度。若标准曲线范围跨度超过3个数量级(例如10～1 000)，或范围内存在非线性区间，建议增加标准品数量或者缩小浓度检测范围。
建议在每个检测批次前运行标准曲线，若实验室的定标频率能保证检测质量，则可视具体情况而定。在实际操作中，标准品的浓度范围应包括LLMI和ULMI，以及分析范围内的所有相关医学决定水平的浓度点。其他的标准品浓度也应设置在校准范围内。LLMI处浓度偏差应在±20%以内，其余浓度偏差应在±15%以内。每个标准品中需加入与质控品及患者样本中相同的IS。以标准品中已知分析物的浓度为X轴，分析物峰面积与IS峰面积比值为Y轴，根据系统内设的分析软件进行不同类型的曲线模型拟合。
建议14 实验室购买和使用商品化的标准品。如无法获得商品化标准品，推荐自行配制且基质需要同临床样本相似。首选CRMs作为配制标准品的参考物质。
建议15 至少使用6个浓度水平的标准品建立标准曲线，LLMI处浓度偏差应在±20%以内，其余浓度偏差应在±15%以内。
在对方法进行全面验证之前，最好在方法开发过程中增加预验证步骤。预验证对方法开发与建立的性能进行快速评估。预验证的作用是评估某些基本的性能参数，如特异性和选择性、基质效应、携带污染和重复性等[5]。
LC－MS系统的进样器、管路连接、管路、色谱柱、离子源甚至质量分析器都可能积存干扰物或目标分析物而造成携带污染，以及在样本提取和衍生化过程也可能导致污染，所以在预验证阶段要通过相关试验来评估方法学的特异性。
方法的选择性即方法能够区分待测分析物(药物或代谢产物)和内源性成分、联合给药药物以及与其他药物相关的化合物(如其他代谢产物即异构体)，同时样本本身介质中也可能存在同分异构体。在方法开发的过程中需要关注内源性同分异构体引起的交叉反应，如睾酮与脱氢表雄酮。应先在色谱上进行预实验加以分离。
建议在整个验证期间通过基质匹配双空白样本信号确认检测系统的背景噪音进行连续监测，以验证方法特异性和选择性。合适的背景噪音需满足以下其中一个条件：(1)无背景峰或背景峰面积小于LLMI处分析物峰面积的20%；(2)小于等于预期保留时间处IS峰面积的5%。对于内源性物质的检测，若无法获得去除待分析物的空白样本，推荐使用与样本基质相似的空白样本代替，并评估基质效应。
基质效应可能会对分析产生一般性或样本特异性的影响，例如由离子抑制效应引起灵敏度或离子化效率的降低，或者由干扰峰导致结果的假阳性，因此评估基质效应是LC－MS方法验证的关键组成部分。离子抑制是即分析信号减弱，是质谱检测中的最常见的干扰现象，因此在基质效应的性能验证项目中必须引起重视、进行评估。这些基质包括溶血、高脂质和来自特殊人群、肝或肾功能受损的患者的基质，例如对红细胞内外浓度差异大的分析物要评估溶血对其检测结果的影响。应分别评估每个通道(包括IS)的基质效应。评估基质效应的影响程度时应当借鉴方法的TEa，TEa包括不精密度、偏倚和干扰。一般建议比较两个浓度、至少各5份患者样本基质和纯溶剂(如流动相)，萃取后加入相同的标准品，比较天然基质与纯溶剂的信号比值来评价基质效应。要求基质效应的CV应<15%。标准曲线和分析物的基质不同时，建议进行基质效应评估。若由于基质效应而引起的离子抑制或离子增强差异过大，建议首选同位素IS用于纠正[6]。
LC－MS是由连续流路组成，这种一体化的检测系统会增加高浓度样本残留风险。目前，尚无临床指南设定LC－MS的允许残留标准，但携带污染不应对检测准确性或精密度产生显著影响。携带污染评估应选取高低浓度样本，按照不同的组合进样，高－低值转换样本均值与低－低值转换样本均值的差小于低－低值转换样本的3SD。根据FDA指导建议，应当在分析高浓度的样本之后立刻进样一份或多份空白样本，以评估残留情况。无论同一次运行的其他样本中分析物的浓度如何，分析空白样本时的检测器信号都应该远低于LLMI。如果携带污染大于规定标准，建议减少进样量并降低最高标准曲线浓度。对未知样本在浓度高于最高标准曲线浓度样本之后进样的结果需要重新分析。
在进行全面验证之前，应采用校准范围内的多个数据点评估重复性。如果重复性未达到要求，应返回方法建立的步骤，对方法进行优化后再评估。重复性评估应在下列3个浓度处进行：110% LLMI、90%ULMI以及50%(LLMI ＋ ULMI)。每种浓度的样本至少重复检测20次，计算CV和回收率。CV和回收率应满足实验室对不同分析物所设定的标准。
建议16 在方法建立过程中进行预验证。预验证需要评估特异性和选择性、基质效应、携带污染和重复性。
实验室对自行开展的项目进行参考区间建立或者引用其他机构参考区间并验证其是否通用。对引用参考区间的验证，需根据项目特点，每个参考区间选择至少20份样本。若自建参考区间，则根据项目特点，选择至少120份样本，对结果进行统计分析，得出参考区间。
在被应用于临床检测前，任何一种质谱方法都需要进行方法学验证。验证的过程中，方法可靠性需要充分评估各种微小变化的影响，如果方法的性能发生显著变化则要求方法重新优化并重复方法学验证。
检测限是指检测方法在规定的实验条件下所能检出分析物的最低浓度，信噪比至少3∶1。确定LoD的一般方法可以参考相关文件[7]。LoD仅用于辅助确定检测方法的LLMI。采用LC－MS定量检测时，不建议报告低于LLMI的检测结果[7]。
定量下限是在满足实验室对准确性和精密度要求的前提下，检测方法在规定的实验条件下所能准确定量检测分析物的最低浓度或最低量。推荐使用3～5个接近LoD浓度的样本，每个浓度总共至少检测10次。该方法可获得结果接近LLMI真值，95%的可能保证检测准确性。LLMI和理论值偏差应在±15%以内，即实测值在理论值的85%～115%范围内，CV应<20%[7]。
建议17 LoD用于辅助确定检测方法的LLMI。采用LC－MS定量检测时，不建议报告低于LLMI的检测结果。
建议18 使用3～5个接近LoD浓度的样本确定LLMI，每个样本至少检测10次。要求LLMI和理论值偏差应在±15%以内，CV<20%。
用于临床的定量检测方法，标准曲线反应了方法可检测的范围，即定量范围。建议选择至少5个浓度的样本，每个样本重复2～4次，使用多元回归方程(如加权最小二乘法)评价线性，记录线性方程和相关系数。任何非线性的情况都需要评估是否具有临床意义。各浓度样本的实测值与理论值之间的偏差应在可接受范围之内(LLMI浓度点的偏差应在±20%以内，其余浓度点的偏差应在±15%以内，CV应<20%)，才能用于临床样本的定量检测[8]。
建议19 评价线性建议至少使用5个不同浓度样本，每个样本重复检测2～4次，要求LLMI浓度点的偏差应在±20%以内，其余浓度点的偏差应在±15%以内，CV<20%。
不精密度验证即目标分析物测定的可重复性，通常用重复检测的CV表示。对于LC－MS定量分析，建议使用CRMs或具有可溯源性的质控品。质控品的配制以及高浓度储存液应该不同于标准品。不精密度验证可以选择低、中、高3个不同浓度的质控品。评价批内不精密度，每个浓度至少测定5次。评价批间不精密度，应在不同批连续制备并测定至少3个分析批次(3个浓度总共不少于45个检测值)。配制的质控样本应能够代表临床样本的特性(如血清)，也可以使用患者的混合样本。需要时，也可以使用商品化的质控品。如果高浓度样本和低浓度样本没有覆盖定量范围，也可以添加标准品，高浓度样本也可以进行稀释。但这两种情况需要充分考虑潜在的基质效应。建议评估标准为LLMI浓度附近低值CV应<20%，其余浓度CV应<15%，也可以依据生物学变异或临床指南的要求[9]。
建议20 选择3个浓度的样本进行不精密度评估，要求浓度覆盖定量范围。
建议21 不精密度验证的评估标准建议为LLMI浓度附近低值CV应<20%，其余浓度CV应<15%，也可以依据生物变异或临床指南的要求。
检测系统准确性可通过方法间比较、检测CRMs或回收实验等进行评估，建议使用一种或多种方法。评估样本类型的优先顺序为患者样本>患者混合样本>血清质控品>非生物水溶液。准确性评估结果需满足生物学变异或临床指南的要求。若结果不符合标准，需评估选参考方法时，可与其进行比较。至少采用40份样本，覆盖整个检测范围。推荐使用患者样本，样本应从检测目标人群中获得[10]。
与其他常规检测方法进行比对，结果仅说明差异程度，不能表示偏倚。这种比较方式不能用于准确性评价，而只能用于辅助计算不同方法参考区间的转化。如果两种检测技术结果有偏差，需要重新建立LC－MS方法检测结果参考区间。
CRMs是有溯源性的参考物质，来源于权威机构或是经参考方法赋值的室间质评物质。建议每个样本分3～5批次检测，每批次重复两次[11]，检测值应该在靶值的±15%以内，低浓度样本的CV<20%。
若无参考方法或参考物质，推荐使用回收实验。建议在3个浓度的质控品或临床样本内，添加已知浓度的标准品，每个浓度至少检测5次。理论值为样本中内源性分析物与加入标准品浓度之和，测定值与理论值的比可用于评价准确性[5]，检测值应该在靶值的±15%以内，低浓度点在±20%以内。
建议22 使用一种或多种方法评价准确性，样本类型选择优先次序为患者样本>患者混合样本>血清质控品>非生物水溶液。准确性的验证方法包括：(1)与参考方法进行比对；(2)检测参考物质；(3)回收实验。
虽然LC－MS具有较高选择性和特异性，但其仍会受许多物质的干扰，如药物及其代谢物质、补充剂、样本基质和性状、抗凝剂、促凝剂等，因此建议对临床样本内常见的干扰因素进行评估，同时需关注同分异构体或同位素的干扰。推荐使用含高浓度干扰物的临床样本进行干扰评估[12]。
对未知干扰物的监测通过离子峰度比，其在批内或批间无显著变化。积累检测方法建立和验证阶段的数据，设定患者样本离子比变化的可接受标准。
此外，色谱峰形、保留时间、分析物与IS的一致性也应进行监测，以评估干扰的存在。
建议23 使用存在高浓度潜在干扰物的患者样本，不建议在基质中人为添加，建议使用离子峰度比率监测是否存在未知干扰。
对于浓度超出定量范围的样本可进行稀释后检测，不推荐使用定量范围外推的方法进行计算。建立试验方法时，必须对相应的稀释方法进行不精密度和回收率评估。回收率用于评估稀释基质的适用性和最大稀释比。稀释一致性评价要求每个稀释浓度至少单独制备5份样本，并使用已建立的定量方法检测每份样本。对于建立未知浓度检测样品的标准曲线时，应考虑该样品的检测浓度可能超过分析仪器的检测阈值上限，因此对这类样品应做相应的稀释，并选择最佳稀释基质和稀释倍数。在浓度大于3倍LLMI时，回收率为100%±15%且CV<15%视为可接受。如回收率超过这个标准提示稀释过度、稀释基质不合适和/或稀释引入基质效应。稀释的回收率和精密度的可接受标准可以根据临床具体应用进行调整。
分析物浓度在定量范围内的样本可能需要进行稀释(如需要对样本受到的离子抑制或增强进行部分校正)。样本提取后，对提取液进行稀释，然后进行测定。应注意避免稀释后分析物浓度小于3倍LLMI，因分析物浓度接近LLMI时，稀释引入的误差将大于LLMI的标准允许误差的20%，方法准确性无法评价。
当分析物浓度大于ULMI时必须进行稀释。同样一般对样本提取液进行稀释然后检测。在这种情况下，稀释液应含有与稀释前样本提取液浓度相同的IS。稀释后的分析物浓度仍在定量范围外时，应报告为"超出检测范围"。必要时需做好标注。
小体积的样本(如婴幼儿通常只能采到25 ～50 μl的血清)可能需要稀释，以达到最小分析体积的要求，确保报告结果的准确性和精密度。此类样本可能来源于不同生理状态或复杂疾病状态的人群，与常规检测样本相比表现出特有的基质差异，根据实际情况不同的稀释基质。
对于小体积样本，通常对原始样本进行稀释，以使样本体积达到最小分析体积的要求。这种稀释需要仔细记录样本和稀释液的体积以计算分析物浓度。同样应注意避免稀释后分析物浓度小于3倍LLMI。如果分析物浓度稀释后小于3倍LLMI，而所有原始样本已用完时，需要将基质类似特性明确的标准品和(或)质控品使用相同方法稀释至浓度在LLMI和3倍LLMI之间，然后进行检测以明确样本检测结果是否可接受。
建议24 建议对稀释方案评估后进行检测。每个稀释浓度至少单独制备5份样本，并满足在浓度>3倍LLMI时，回收率为100±15%，CV<15%。
建议25 浓度超出定量范围的样本建议适当稀释，若用最大稀释比稀释后浓度仍超出定量范围，则报告为"超出检测范围"。
建议26 为校正样本内离子抑制或增强的情况，或保证微量样本的检测体积，建议稀释后再检测，应避免稀释后分析物浓度<3倍LLMI。
样本的稳定性受限于多种影响因素，应评估在各种基质效应、环境和储存、容器等条件下的样本稳定性。需要实验室对每个分析物进行稳定性研究。建议用≥3等份的低和高浓度进行冻融稳定性实验，评估短期温度稳定性，－20 ℃或－80 ℃的长期稳定性，储备液稳定性和制备后稳定性(即自动进样器中的时间)[13]。
须评估实验室的自配质控品样本的储存条件和稳定性。质控品存储不当或降解对于临床应用是不能接受的。
实验室须评估自配或商品化内标的稳定性和纯度，保证检测结果的稳定可靠。
已完成验证的方法：当(1)需要转移到同类型仪器或软件平台或者由不同操作者进行样品分析、(2)样本采集的抗凝剂发生变化、(3)基质变化、(4)样品预处理流程变更、(5)浓度范围变化时，必须进行方法学验证。验证需要包括仪器交叉污染，批间、批内精确度和准确度方面的考察。
LC/MS认证报告中需要涵盖：仪器型号、耗材、标准品、QC样品信息、具体试验方法步骤、LC/MS建立方法、实验方法认证每一部分的结果以及结论以及原始数据保存记录。
LC/MS作为实验室自建项目，实验室主任需要确保LC/MS在开展前完成：检测性能确立与临床应用评估、建立完善的质量控制体系、编写从标本采集到结果解释全过程的规范化操作规程，并且签字许可新的LC/MS方法认证报告以及执行。
执笔：郭玮、陈文祥、尚红、潘柏申
参与编写的专家(按姓氏汉语拼音排序)：曹志民(美国纽约州卫生厅Wadsworth科研及临床检验中心)；陈文祥(卫生计生委临床检验中心)；程雅婷(广州金域检验医学中心临床质谱检测中心)；郭玮(复旦大学附属中山医院检验科)；江涛[沃特世科技(上海)有限公司]；居漪(上海市临床检验中心)；李水军(复旦大学附属中山医院徐汇医院中心实验室)；李岩(中国科学院生物物理研究所)；刘华芬(迪安诊断－凯莱谱精准医疗检测技术公司)；潘柏申(复旦大学附属中山医院检验科)；尚红(中国医科大学附属第一医院)；王蓓丽(复旦大学附属中山医院检验科)；王思合(美国克利夫兰医疗中心)；朱玉胜(美国Hershey医学中心病理核心参考实验室)
参与意见征求的专家(按姓氏汉语拼音排序)：府伟灵(第三军医大学第一附属医院)；郭健(北京医院)；郝晓柯(第四军医大学西京医院)；胡丽华(华中科技大学同济医学院附属协和医院)；马筱玲(安徽省立医院)；潘世扬(南京医科大学第一附属医院检验科)；彭林(天津市儿童医院)；沈立松(上海交通大学医学院附属新华医院)；王兰兰(四川大学华西医院检验科)；王前(南方医科大学)；王成彬(解放军总医院)；王传新(山东大学第二医院)；王培昌(首都医科大学宣武医院)；魏军(宁夏医科大学总医院)；续薇(吉林大学第一医院)；张捷(北京大学第三医院)；张曼(首都医科大学附属北京世纪坛医院)；张展(郑州大学第三附属医院河南省妇幼保健院)；张军力(内蒙古医科大学附属医院)；仲人前(第二军医大学附属长征医院)
