肺炎链球菌是临床重要的致病菌，除可引起鼻窦炎和中耳炎外，更是引起脑膜炎、肺炎、败血症等严重疾病的首位病原菌[1]。此外，肺炎链球菌引起的感染常导致严重后遗症，如肺炎链球菌引起的化脓性脑膜炎的神经系统后遗症为30%～52%，包括听力丧失、局灶性神经功能缺损和认知功能障碍[2]。同时，肺炎链球菌性疾病的高死亡率也不容忽视。2005年WHO的数据显示：全球每年由肺炎链球菌感染导致死亡的病例达160万，其中70万～100万为5岁以下儿童，大部分来自发展中国家[3]。有数据显示，中国13%～53%的肺炎链球菌可引起儿童的社区获得性肺炎，7%～9%引起细菌性脑膜炎[4,5,6]；此外，中国是全球范围内肺炎链球菌引起感染病例数最多的国家之一，占全球病例的12%；也是5岁以下儿童肺炎链球菌感染引起死亡的病例数最多的国家之一[7]。
为有效控制肺炎链球菌感染的传播及降低疾病造成的危害，建立准确、快速、统一的检测方法是首要任务[8]。然而，目前国内尚无肺炎链球菌的参考实验室，且肺炎链球菌的病原学检测方法各不相同。故本共识对标本采集、转运、培养、鉴定、保存、血清分型、体外药敏等均进行了详细阐述，这将有助于推动肺炎链球菌病原学检测方法的标准化，也为肺炎链球菌性疾病的预防和治疗提供基础。
肺炎链球菌的病原学检测方法有：细菌培养、抗原检测、抗体检测和分子生物学等。
超细鼻咽拭子(美国Fisherbrand公司海藻酸钙纤维超细铝贴标无菌拭子)；脱脂牛奶-胰蛋白胨-葡萄糖-甘油(skim milk-tryptone-glucose-glycerol，STGG)标本转运管[配方：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tryptone soya broth，TSB)3 g；葡萄糖0.5 g；脱脂奶粉2 g；甘油10 ml；蒸馏水100 ml]；CO2孵育箱；血培养瓶；5%脱纤维羊血平皿；接种环；optochin纸片；培养基；比浊仪；标本冻存管(配方1：TSB 50 ml；马血清40 ml；甘油10 ml。配方2：TSB 10 g；酵母提取物1 g；琼脂0.166 g；蒸馏水233.3 ml；马血清100 ml)；－80 ℃低温冰箱保存。抗菌药物敏感试验药物：青霉素、红霉素、阿莫西林/克拉维酸、左氧氟沙星、克林霉素、万古霉素、莫西沙星、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢克洛、亚胺培南、美罗培南。
标本应在抗菌药物使用前采集。采集后应该立即常温送检，一般不超过1 h，如不能立即送检，可室温保存，切勿冷藏。有些市售的商品培养瓶加入血液后室温最长可放置24 h。对于标本的转送，应严格按照我国卫生部发布的有关病原微生物标本运送的法律法规执行。
目前，常规采集的标本种类主要包括：血液、脑脊髓液、胸腔积液、腹腔积液、关节腔积液、鼻咽分泌物、痰等。血液、脑脊髓液、胸腔积液、腹腔积液、关节腔积液的采集应遵循临床操作规程，其标本采集的送检要点见表1。
侵袭性标本的采集送检要点
侵袭性标本的采集送检要点
| 标本 | 采集时间 | 标本量(ml) | 装置/培养基 | 运送时间(h) | |
|---|---|---|---|---|---|
| 儿童 | 成人 | ||||
| 血液 | 抗菌药物使用前 | 1～5 | 8～10 | 血培养瓶 | 1 |
| 脑脊髓液 | 抗菌药物使用前 | 1～2 | 1～2 | 无菌瓶和(或)血培养瓶 | 1 |
| 胸腔积液/腹腔积液 | 抗菌药物使用前 | 1～2 | 5～10 | 无菌瓶和(或)血培养瓶 | 2 |
| 关节腔积液/骨髓 | 抗菌药物使用前 | 1～2 | 1～5 | 无菌瓶和(或)血培养瓶 | 2 |
可使用超细鼻咽拭子。(1)向后倾斜患者头部呈70度角。将鼻咽拭子沿一侧鼻腔插入，直到遇到阻力。注意：插入咽拭子时应与患者鼻咽底部平行。患者有时可能会有轻度瘙痒或少量流泪。(2)将拭子停留5～10 s，并旋转2～3次以吸收分泌物。(3)取出鼻咽拭子，直接插入含有STGG的标本转运管，折断拭子手柄，盖紧标本转运管的螺帽，转运管壁标记清楚患者编号。或取出鼻咽拭子后直接转种于5%脱纤维羊血平皿上。(4)标本转运管可在室温进行转运，最长可持续8 h。或漩涡振动10～20 s后－70 ℃冰箱保存。
病房吸痰前，可以超声雾化、轻拍背促进患儿排痰。(1)采取卧位，助手限制患儿四肢和身体运动。(2)关闭负压吸引，将吸痰管(采用一次性吸痰管)经鼻腔插入。插入深度约为患儿鼻尖至耳垂，再至甲状软骨的距离，或头顶至甲状软骨的距离。达到相应深度时患儿可能会出现咳嗽或咳嗽加剧表现。(3)开启负压吸引，吸痰入痰壶。吸痰时可一边吸痰，一边转动吸痰管。注意不能一边吸一边退。(4)关闭负压吸引，取出吸痰管。如果因为治疗或护理需要继续吸痰，需要将痰壶更换。(5)立即将痰标本送检。(6)注意观察导管外壁有无血迹，操作后观察患儿反应，有无鼻腔出血、呕吐、呼吸暂停、心律失常发生，及时发现及时处理。
(1)按常规进行纤支镜检查。(2)首先对在拟要灌洗肺段经活检孔注入2%利多卡因1～2 ml，做灌洗肺段局部麻醉。(3)然后将纤支镜顶端楔入段或亚段支气管开口处，再从活检孔快速注入37 ℃灭菌生理盐水，立即以50～100 mm Hg(1 mm Hg＝0.133 kPa)负压吸引回收液体，每次注入30～50 ml，总量100～250 ml，一般不超过300 ml，通常回收率可达40%～60%。(4)立即将回收液用双层无菌纱布过滤，除去黏液，并记录总量。(5)装入硅塑瓶或涂硅灭菌玻璃容器中(减少细胞黏附),置于含有冰块的保温瓶中，立即送往实验室检查。
采集清晨第一口痰，留取痰液前需用生理盐水漱口，经深呼吸数次用力咳出痰液。按呼吸科常规对痰标本进行是否合格检查。
STGG标本送到实验室后，将STGG放入CO2孵育箱孵育，35 ℃，4 h，然后震荡10～20 s，取40 μl液体转种于5%脱纤维羊血平皿上。为了提高肺炎链球菌培养的阳性率，抑制杂菌，可使用含庆大霉素的5%脱纤维羊血胰蛋白胨大豆琼脂(tryptone soya agar，TSA)培养基：将80 mg庆大霉素加入32 ml无菌蒸馏水中，配制成储存液(浓度为2.5 mg/ml)，过滤除菌。在5%脱纤维羊血TSA培养基50 ℃时加入庆大霉素储存液，体积比为500∶1，庆大霉素最终浓度为0.005 g/L。然后35 ℃ 5% CO2过夜孵育。
侵袭性标本的培养要点是增菌过程：抽取脑脊髓液、胸腔积液、腹腔积液和关节腔积液后应立即加入增菌肉汤中，置于35 ℃摇床上震荡过夜，如果增菌液变混浊，转种于羊血平皿上，如果增菌液仍清亮，继续在摇床上振荡至72 h。血培养按检验科常规进行。
选择有草绿色溶血环(也称α-溶血)，边缘整齐，呈脐窝状的菌落。
(1)optochin实验：挑取被检菌落，均匀涂在血平皿上，贴上optochin纸片，35 ℃ 5% CO2过夜孵育。optochin纸片周围抑菌环直径>14 mm视为optochin实验阳性，可以确定待测菌株为肺炎链球菌。若抑菌圈直径<14 mm时参照胆汁溶菌试验，或为其他草绿色链球菌。(2)胆汁溶菌试验：用10%去氧胆酸钠溶液直接滴在可疑菌落上，置35 ℃孵箱15～30 min后，观察被检菌是否已溶解，溶解判断为阳性。
多价血清凝集试验。选择成品试剂盒按说明书进行凝集。
抗菌药物敏感试验是测定抗菌药物或其他抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力，判断抗菌药物是否对病原菌有效，从而指导临床合理用药和检测细菌耐药情况。
目前推荐的检测肺炎链球菌抗菌药物药敏试验的方法有：微量肉汤稀释法[美国临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐][9]、琼脂稀释法、E-test法和K-B法。抗菌药物包括：青霉素、阿莫西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢克洛、红霉素、克林霉素、万古霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、亚胺培南、美罗培南。
原理：微量肉汤稀释法是定量测定抗菌药物抑制细菌生长的体外方法。将受试细菌接种在一系列抗菌药物浓度成对倍稀释的液体培养基内，经35 ℃孵育16～20 h后肉眼未见生长的最低浓度称为该抗菌药物能抑制该受试细菌的MIC。操作步骤如下。
抗菌药物贮存液浓度不应低于1000 mg/L(如1280 mg/L)或10倍于最高测定浓度(溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度)。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可用下面的公式进行计算。
CLSI推荐使用含2%～5%裂解马血(冻融马血)的阳离子调节的Mueller-Hinton Broth(CAMHB)肉汤，pH 7.2～7.4。
(1)制备抗菌药物保存液：保存液浓度为受试抗菌药物最高受试浓度的2倍，如最高受试浓度为32 mg/L，保存液应配制浓度为32 mg/L×2＝64 mg/L。为保存方便可配制1280 mg/L，放置低于－20 ℃的冰箱中。(2)制备工作液：保存液1280 mg/L，稀释20倍至64 mg/L，并对倍稀释成64、32、16、8…0.125 mg/L，10个对倍稀释系列(见表2)。(3)取8×12的96孔U底板，将上述稀释后的受试抗菌药物的浓度系列工作液逐一加入相应的微孔板A～H的10个小孔内，每孔100 μl。(4)每株细菌和每种抗菌药物均应有一个未加细菌的空白对照孔(阴性对照)和一个细菌生长对照孔(阳性对照)，在96孔U底板上应该是第11孔和第12孔。所以A11～H11和A12～H12加等量的抗菌药物稀释液(如磷酸缓冲液，或无菌水等)。(5)试验时A11～H11加等量的双倍冻融马血-CAMHB肉汤，A12～H12加等量的受试菌液。
肉汤稀释法常用抗菌药物溶剂稀释法
肉汤稀释法常用抗菌药物溶剂稀释法
| 药物浓度(mg/L) | 取药液量(ml) | 加稀释剂量(ml) | 药物稀释后浓度(mg/L) | 肉汤最后含药浓度a(mg/L) |
|---|---|---|---|---|
| 1280(原液) | 1 | 4 | 256 | 128 |
| 256 | 1 | 1 | 128 | 64 |
| 128 | 1 | 1 | 64 | 32 |
| 64 | 1 | 1 | 32 | 16 |
| 32 | 1 | 1 | 16 | 8 |
| 16 | 1 | 1 | 8 | 4 |
| 8 | 1 | 1 | 4 | 2 |
| 4 | 1 | 1 | 2 | 1 |
| 2 | 1 | 1 | 1 | 0.5 |
| 1 | 1 | 1 | 0.5 | 0.25 |
| 0.5 | 1 | 1 | 0.25 | 0.125 |
| 0.25 | 1 | 1 | 0.125 | 0.06 |
注：a药物∶肉汤＝1∶1
微量稀释板制备好后用塑料袋封闭，立即置于≤－20 ℃(最好是≤－60 ℃)保存备用。虽然抗菌药物在冷冻的稀释板中可稳定数月，但某些药物(如克拉维酸和亚胺培南)较不稳定，应需现用现配。不要将稀释盘放在自动除霜的冰箱中。融化后的药物溶液不能再冷冻，反复冻融可加速一些抗菌药物特别是β内酰胺类药物的降解。
采用生长法或直接菌悬液法制备受试菌菌悬液。菌液浓度相当于0.5麦氏比浊管标准。经冻融马血-CAMHB肉汤1∶1000稀释后，向含抗菌药的微量板的每孔中加100 μl受试菌菌悬液，盖好盖子，置于微量板混匀器上轻微震荡混匀后置于35 ℃普通空气孵箱中，孵育20～24 h判断结果。此时，第1孔至第10孔药物浓度分别为32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06 mg/L。注意，制备菌悬液的肉汤必须是双倍浓度的冻融马血-CAMHB。
以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当A12～H12阳性对照孔(即不含抗菌药物)内细菌明显生长和A11～H11阴性对照孔无细菌生长，试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言。
原理：定量测定抗菌药物抑制细菌生长的体外方法。将被检细菌接种于一组含有不同稀释度抗菌药物的培养基内，经35 ℃孵育一定时间，稀释法所测得的某抗菌药物能抑制细菌肉眼可见生长的最低浓度称为MIC，即为细菌对该抗菌药物的敏感度。操作步骤如下。
按稀释待测抗菌药物，分别取1 ml加入内径为90 mm的培养皿中。
取高压灭菌后温度降至50 ℃左右的MH琼脂培养基19 ml加入到培养皿中(药物∶琼脂＝1∶19)，水平摇晃培养皿，使药物和琼脂充分混匀。肺炎链球菌需在MH琼脂中加入5%脱纤维羊血。
复苏、传代细菌，用无菌棉棒挑取纯菌落制成生理盐水悬液，校正浊度至0.5麦氏标准浊度。
吸取20 μl左右菌液至接种器各孔中，用接种器蘸取孔中菌液对培养皿逐个接种。接种时应先接种含药浓度低的平板，然后再含药浓度高的平板。放入35 ℃ 5%CO2孵箱中培养20～24 h(肺炎链球菌)。
菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该药对细菌的MIC，记录结果，按照CLSI 2010标准[9]判断敏感、中介及耐药。
原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种细菌的培养基上，纸片中所含的抗菌药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内细菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌环。抑菌环的大小反映细菌对测定药物的敏感程度，并与该药对细菌的MIC呈负相关关系，即抑菌环愈大，MIC值愈小。操作步骤如下。
在冷却至50～60 ℃的高压无菌的MH琼脂内加入脱纤维羊血，使羊血浓度为5%，旋转培养基并使之混匀。在90 mm内径的培养皿内加入25 ml 5%脱纤维羊血-MH琼脂，厚度为4 mm。
复苏、传代细菌，用无菌棉棒挑取纯菌落制成生理盐水菌悬液，校正菌液浊度至0.5麦氏标准浊度。
(1)用无菌棉棒蘸取0.5麦氏浊度的菌悬液，将多余的菌液在液面上的试管壁内轻轻旋转挤出多余的菌液，然后均匀地划线涂布在5%脱纤维羊血-MH培养基表面，在培养基表面均匀划线涂布3次，每次旋转60度，以确保接种菌的均匀分布，最后沿内缘划一周，以取得均匀接种。(2)接种好的平板可敞开盖子在室温下干燥3～5 min，在15 min内完成药敏纸片的放置。
用无菌镊子夹取抗菌药物纸片贴在涂好细菌的培养基上，并轻压纸片使之紧贴培养基表面，放入35 ℃ 5%CO2孵箱中培养20～24 h。
用直尺或游标卡尺测量抑菌环直径，并记录结果，按照CLSI 2010标准判断敏感、中介及耐药。
原理：基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向药敏培养基中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内细菌的生长被抑制，从而形成透明的椭圆形抑菌环。E-test结合了稀释法和扩散法的原理和特点，操作简便同扩散法，但可以同稀释法一样直接定量检测出测试药物对细菌的MIC值，结果准确，重复性好。操作步骤如下。
5%脱纤维羊血-MH平皿的制备、菌液制备、细菌接种同纸片法。
用无菌镊子夹取E-test条贴在涂好细菌的培养基上，并轻压试条排出空气使之紧贴培养基表面，放入35 ℃ 5%CO2孵箱中培养20～24 h(肺炎链球菌)。
椭圆形抑菌环和试条相交处切线所指的刻度即是受试抗菌药物对细菌的MIC的读数，记录结果，按照CLSI 2010标准判断敏感、中介及耐药。各种抗生素敏感试验方法的优缺点见表3。
抗生素敏感试验方法优缺点
抗生素敏感试验方法优缺点
| 项目 | 琼脂稀释法 | 微量肉汤稀释法 | E-test法 | 纸片扩散法 |
|---|---|---|---|---|
| 准确性 | 标准化，可重复 | 标准化，可重复 | 与微量肉汤稀释法高度一致 | 定性试验，不能评价MIC |
| 价格 | 适中 | 适中 | 昂贵 | 便宜 |
| 试验耗时性 | 准备耗时长 | 准备耗时长 | 16～20 h | 16～18 h |
| 技术和设备需求 | 适中 | 适中 | 低 | 低 |
| 试剂稳定性 | 抗生素溶液不能事先准备很久，可失去活性 | 抗生素溶液不能事先准备很久，可失去活性 | 纸条可在冷冻状态保存很长时间 | 纸片可在冷冻状态保存很长时间 |
| 对临床治疗指导 | 好 | 好 | 好 | 中等 |
| 对耐药性监测 | 好 | 好 | 好 | 粗略监测耐药趋势 |
肺炎链球菌质控菌株为ATCC49619。抗生素敏感试验结果按照CLSI 2010标准判断敏感、中介及耐药。
肺炎链球菌的菌种保存方法有多种，主要分为使用保护液冻存法、定期移植保存法和冷冻真空干燥法3类。冷冻真空干燥法是迄今最佳的菌种保存方法，保存时间可达数年或十年以上，但所需专用仪器一般实验室难以配备。保护液冻存法优点是冻存液可以自己配制亦可直接购买商品化的产品，缺点是保护液冷冻保存肺炎球菌一般只能保存数月。定期移植保存法的条件不高，但需每半个月移种一次，频繁的传代接种容易导致杂菌污染及菌种变异，并且要耗费较多的人力物力。
国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》[10](2004年)第18条：国家根据实验室对病原微生物的生物安全防护水平，并依照实验室生物安全国家标准的规定，将实验室分为一至四级。在《人间传染的病原微生物名录》[11]中，肺炎链球菌被列为第3类病原微生物，与其相关的分离培养及分子生物学等实验活动(操作)要在二级实验室内进行。
肺炎链球菌的血清分型主要包括血清学分型和分子生物学分型两种。血清学分型方法包括棋盘式分型系统(pneumotest kit)、荚膜肿胀试验等。
棋盘式分型系统操作简便、迅速，且费用低廉，可以分出最常见的20多种致病血清型/群，是一般微生物实验室进行肺炎链球菌血清分型的理想方法[12]。但棋盘式分型系统不能进行所有血清型的分型，即使能分型的20多种血清型/群中，有的(如7、10、12、15、18、19、22、23、33群)只能分到群，如果要细分型，需要使用单因子抗血清。能确定所有93个血清型才是专门参考实验室必备的条件[13,14]。
使用肺炎链球菌荚膜多糖抗原免疫动物，获得的抗血清与相应荚膜抗原可特异性结合形成复合物，油镜下可见细菌荚膜显著增大，菌体肿胀，多个细菌可以凝集成团。
抗血清池(pool antisera)和单因子抗血清(factor antisera)均为丹麦国家血清研究院制造。
(1)在5%脱纤维羊血培养基上复苏肺炎链球菌菌株，35 ℃ 5%CO2孵箱过夜培养。(2)次日挑取单个菌落转种于另一个5%脱纤维羊血培养基上，培养同前。(3)用无菌棉签挑取适量的菌落至磷酸缓冲液(PBS)或生理盐水中，混匀形成悬液。(4)1.5 μl细菌悬液放置载玻片上，每个显微镜视野里细菌数不要太多。(5)分别加入1.5 μl纵列和横行分型血清池，与细菌悬液充分混合(见表4及图1)。例如，首先B池分别与P、Q、S池混合，再与细菌悬液混合，如果B＋P＋菌液出现肿胀和凝集反应，血清型是19群；如果没有反应，做B＋Q＋菌液，依此类推。(6)立即盖上盖玻片，避免吹干。(7)在相差显微镜的油镜下观察细菌大小、荚膜肿胀和凝集状况。在半小时内，反应稳定。(8)加入血清池的顺序见图1，具体操作顺序从上到下、从左到右。(9)镜下细菌体积明显变大、可见荚膜肿胀者为阳性；阳性者多数还可见细菌或多或少的成团聚集(图2)，荚膜大小与菌株生长条件和血清型有关。
棋盘系统对肺炎链球菌分型和(或)群a
棋盘系统对肺炎链球菌分型和(或)群a
| 抗血清池 | Pb | Qb | Rb | Sb | Tb | 非疫苗相关的型或群 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| A | 1d | 18cd | 4d | 5d | 2d | － |
| B | 19cd | 6cd | 3d | 8d | － | － |
| C | 7cd | － | － | － | 20d | 24c、31、40 |
| D | － | － | 9cd | － | 11cd | 16c、36、37 |
| E | － | － | 12cd | 10cd | 33cd | 21、39 |
| F | － | － | － | 17cd | 22cd | 27、32c、41c |
| H | 14d | 23cd | － | 15cd | － | 13、28c |
注：a为所有46个型或群显示在表中(26号和30号已不用)。b为P到T 5个组示与21价疫苗相关的型和(或)群中的一种抗血清和A到F及H组之一反应。c为表示该群含有以下型：6：6A和6B；7：7F、7A、7B和7C；9：9A、9L、9N和9V；10：10F和10A；11：11F、11A、11B和11C；12：12F和12A；15：15F、15A、15B和15C；16：16F和16A；17：17F和17A；18：18F、18A、18B和18C；19：19F、19A、19B和19C；22：22F和22A；23：23F、23A和23B；24：24F、24A和24B；28：28F和28A；32：32F和32A；33：33F、33A、33B和33C；41：41 F和41 A。d目前使用的23价肺炎链球菌疫苗中存在的型和(或)群。"－"示无此型。对于7、10、12、15、18、19、22、23、33群的肺炎链球菌，棋盘式分型系统只能分到群，细分型需要使用单因子抗血清
注：分别加入1.5 μl纵列和横行分型血清池，与细菌悬液充分混合。例如，首先B池分别与P、Q、S池混合，再与细菌悬液混合，如果B＋P＋菌液出现肿胀和凝集反应，血清型是19群；如果没有反应，做B＋Q＋菌液，依此类推
注：a图为荚膜肿胀试验阳性，b图为荚膜肿胀试验阴性(相差显微镜，油镜×1000倍)
注意：每株细菌检测前均做细菌悬液镜下观察，作为阴性对照。以血清型1型菌株及其抗血清混合后的结果作为阳性对照。
操作步骤和结果判断：(1)在普通羊血培养基上复苏肺炎链球菌菌株，35 ℃ 5% CO2孵箱过夜培养。(2)次日挑取单个菌落转种于另一个普通羊血培养基上，培养同前。(3)用无菌棉签挑取适量的菌落至PBS或生理盐水中，混匀形成悬液。(4)1.5 μl细菌悬液放置载玻片上，每个显微镜视野里细菌数不要太多，浓度为麦氏管2～4。(5)分别加入1.5 μl分型血清，与细菌悬液充分混合。(6)立即盖上盖玻片，避免吹干。(7)在相差显微镜的油镜下观察细菌大小、荚膜肿胀和凝集状况。在半小时内，反应稳定。(8)每株细菌检测前均做细菌悬液镜下观察，作为阴性对照，镜下细菌体积明显变大、可见荚膜肿胀者为阳性。
注意事项同棋盘式分型系统。
PCR与多重PCR方法的试验用引物及操作步骤参考美国疾病预防和控制中心网站：http：//www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/pcr.htm。这种方法经济、快速、便捷；但是需要特殊的设备[15,16,17,18,19,20]。
肺炎链球菌性疾病是全球重要的公共卫生问题。肺炎链球菌的实验室检测是进行肺炎链球菌流行病学研究和监测的基础。但是，目前中国肺炎链球菌的检测方法多样、结果可比性差、缺少国际认同。因此，由俞桑洁、王辉、沈叙庄、倪语星、王传清、杨帆、张泓、朱德妹、杨永弘共9位临床检验专家提议制定一个适合中国国情的肺炎链球菌的临床检验规程。初稿形成后由专家组成员几经修改形成专家共识，旨在为我国肺炎链球菌性疾病的大范围流行病学调查、疾病负担调查提供可靠和统一的方法，为制定针对肺炎链球菌性疾病的国家免疫策略提供可靠的支撑。
