膀胱癌是中国人常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。据报道，2015年膀胱癌发病率位居中国男性癌症的第7位［1］。与欧美国家相似，国内膀胱癌最常见的病理组织学类型为尿路上皮癌（占91.4%），而鳞状细胞癌（占1.8%）和腺癌（占1.9%）相对少见［2］。膀胱癌在临床上可分为非肌层浸润性和肌层浸润性两大类，其中非肌层浸润性癌的预后相对较好（行根治性膀胱切除术后的5年无病生存率超过80%），而肌层浸润性癌由于无较好治疗手段其预后较差，肌层浸润性癌伴远处转移者的5年生存率仅为8.1%［3］。
近年来，抗程序性细胞死亡受体1（PD-1）及其配体（PD-L1）的单克隆抗体已在多种晚期恶性肿瘤的治疗中表现出高效的抗肿瘤活性和可控的安全性，其中包括膀胱尿路上皮癌［4, 5, 6, 7, 8］。目前临床资料表明，抑制PD-1/PD-L1免疫检查点的免疫治疗药物可以用于无法耐受铂类化疗的转移性膀胱癌患者的一线药物治疗以及经过一线铂类化疗后病情进展患者的二线治疗［4，9］。与PD-L1低表达或无表达的患者相比，PD-L1高表达患者的免疫治疗效果更好。已有临床试验证实PD-L1抑制剂德鲁单抗（Durvalumab）在接受以铂类为基础的化疗后出现进展的转移性尿路上皮癌患者中具有良好疗效。根据该研究的结果，PD-L1高表达的患者相比PD-L1低表达或不表达的患者临床获益更多，两者客观缓解率分别为27.6%和5.1%，中位总生存时间（OS）分别为20.0个月和8.1个月［7］。因此PD-L1表达的检测有望成为预测德鲁单抗等PD-L1抑制剂治疗转移性尿路上皮癌疗效的生物标志物。
同其他许多肿瘤的PD-L1检测不完全一样，在膀胱浸润性尿路上皮癌中，肿瘤相关免疫细胞（简称IC）的PD-L1染色同肿瘤细胞胞膜染色一样具有预测免疫治疗疗效的价值。在上述临床试验中证实，可以应用PD-L1（SP263）免疫组织化学染色（IHC）方法检测来评估膀胱浸润性尿路上皮癌中肿瘤细胞和IC中的PD-L1表达。PD-L1高表达定义为肿瘤细胞或IC阳性染色比例≥25%，在有治疗反应的患者中肿瘤细胞或IC的PD-L1高表达的几率更高。因此，病理科和相关临床医师需要对膀胱浸润性尿路上皮癌中PD-L1（SP263）的IHC染色情况进行详细的判读［7］。由于膀胱浸润性尿路上皮癌免疫治疗的机制较复杂，治疗效果同时还受到许多其他肿瘤分子生物学因素的影响，如微卫星不稳定性（MSI）、肿瘤突变负荷或新抗原负荷、PD-L1基因扩增状态以及肿瘤微环境中CD8阳性T细胞数量等［10］。虽然目前PD-L1（SP263）的IHC检测在多数情况下为膀胱癌免疫治疗的辅助诊断，但国家药品监督管理局已批准PD-L1（SP263）高表达用于替雷利珠单抗注射液的伴随诊断，因此对尿路上皮癌而言PD-L1检测的重要性日趋明显，鉴于国内对于膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）的IHC检测染色及判读尚无统一的规范，为了更好地预测患者对PD-L1抑制剂治疗的反应和指导临床用药，中华医学会病理学分会泌尿与男性生殖系统疾病病理专家组在2017年至2019年间在全国12家大型医院病理科参与的多中心研究基础上，进行了多次有针对性的理论及操作培训，并召开了数次学组会议进行了深入的讨论，最终制定了膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）免疫组织化学检测规范的专家共识意见（以下简称“共识意见”）。
1.检测适用范围：共识意见建议所有经病理诊断为浸润性尿路上皮癌的膀胱根治标本均有必要进行PD-L1的IHC检测；对于肌层浸润的复发病例以及局部晚期或出现远处转移的病例，如能获得活检标本且有足够的肿瘤细胞时也建议进行PD-L1的IHC检测［7，11］。
2.膀胱镜活检标本的要求：临床医师取材时应该尽量避开变性、坏死区域，多点活检有助于减少肿瘤异质性的影响，提高检测的准确性。
3.检测方法：IHC方法为检测PD-L1表达的首选方法。PD-L1（SP263）检测目的是评估经3.7%中性甲醛缓冲液固定、石蜡包埋的浸润性尿路上皮癌组织中PD-L1的蛋白表达水平，推荐采用兔抗PD-L1单克隆（克隆号：SP263）并在相应的自动化免疫组织化学染色仪上进行。
1.标本的规范化固定：是膀胱癌PD-L1（SP263）检测质量的保障。活检标本一经取材应立即置入3.7%中性甲醛溶液，固定液的量应至少为组织体积的10倍，固定6~24 h。膀胱癌根治标本应在离体后1 h内送至病理科（离体冷缺血时间不超过30 min为佳），进行标记、剖开和及时固定［12］。固定时将手术标本每隔5~10 mm平行切开，浸没于3.7%中性甲醛缓冲溶液中，固定液的体积应至少为组织的10倍，固定时间为12~48 h。
2.免疫组织化学检测：（1）组织切片的准备：选取蜡块时应避开变性、坏死和肿瘤组织少的区域。建议优先选用近期蜡块。未染色的切片如果不能及时行免疫组织化学检测，建议放在4 ℃冰箱内保存，若放置在室温下不宜超过2周，以防抗原丢失；用于IHC染色切片厚度以4 μm为宜。不推荐经过脱钙处理的标本进行PD-L1检测。（2）评价的目标切片和对照切片：①评价尿路上皮癌PD-L1（SP263）的IHC染色必须制备3张连续切片：HE染色切片、IHC染色阴性对照切片（同型匹配的阴性对照抗体）和PD-L1（SP263）IHC染色切片各1张。②每批次IHC染色要设立阳性对照，阳性对照可采用正常人足月胎盘组织。胎盘组织中的滋养叶细胞对PD-L1（SP263）呈中到强的细胞膜均匀着色和弱至强的细胞质均匀着色，而在间质和血管中不着色。
3.染色质量的判断：如果PD-L1（SP263）的IHC染色质量不符合要求，需要重新染色或者重新选择蜡块（图1）。若出现下述情况之一，需要寻找原因，重新染色：（1）在HE切片的肿瘤区域中肿瘤细胞<100个；（2）阳性对照切片染色不合格；（3）阴性对照切片染色不合格。
4.结果判读和评分（图2, 3, 4, 5, 6, 7）：（1）镜下观察HE切片中的肿瘤面积和IC范围。肿瘤面积包括浸润性肿瘤实质、肿瘤相关促纤维反应的间质、肿瘤实质内的和与肿瘤相关间质内的免疫细胞。淋巴管内的肿瘤细胞不计入肿瘤面积。（2）IC的范围包括：①在肿瘤区域内成簇聚集的；②在肿瘤反应性间质内聚集的，以及③在相邻肿瘤岛之间侵入肿瘤实质内的免疫细胞。其中在肿瘤反应性间质内聚集的IC区域必须与肿瘤紧密相邻，相邻的肿瘤岛之间的距离不超过一个10倍镜视野宽度（2 mm）。IC的种类包括淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞和与坏死无关的中性粒细胞。淋巴管内的免疫细胞不计入此范围。（3）免疫细胞比例（ICP）是IC总面积与肿瘤面积的比值，其比值记为0、1%、5%以及四分位数和十分位数：10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%和100%。如果实际数值在两档之间，按照数学四舍五入方法选取最接近者。如在1%到5%之间，原始数据为2%则归为1%，若为3%或4%则归为5%。如果IC在肿瘤的间质中呈弥漫散在分布，则需要把免疫细胞区域“浓聚”在一起计算面积，而不是“稀释”在间质里连间质区域一起计算。（4）PD-L1（SP263）IHC染色切片对肿瘤细胞及IC需要分别评估表达情况。（5）建议在数字扫描切片中进行全片判定。若无法进行切片数字扫描，建议在光学显微镜的4倍或10倍物镜下将肿瘤组织划分多个区域，在10倍或20倍物镜下具体计算各区域肿瘤细胞与IC的表达，经过整张切片的仔细观察，根据各区域百分比及表达情况，计算出肿瘤组织表达数值。（6）评价肿瘤细胞阳性比例。肿瘤细胞阳性定义为瘤细胞的细胞膜部分或全部着色且强度明显高于背景染色。TC阳性比例按照四分位数和十分位数计数：0、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%和100%。如果实际数值在两档之间，参照ICP的相关原则进行计数。（7）评价IC阳性比例。在免疫细胞区域内IC的任何细胞膜、细胞质的弥漫或颗粒状着色都判读为免疫细胞阳性。阳性的比例按照四分位数和十分位数计数：0、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%和100%。如果实际数值在两档之间，参照ICP的相关原则进行计数。即使肿瘤细胞阳性，仍然需要评价免疫细胞。在ICP为1%的病例中，免疫细胞阳性比例的记录仅有3种可能：0、<100%或100%。（8）判读标准：PD-L1（SP263）的表达水平由浸润性癌组织中肿瘤细胞和IC阳性比例决定。IC占肿瘤的比例也被用于评估是否存在PD-L1高表达。如果达到下列标准之一，认为存在PD-L1高表达；反之则为PD-L1低表达：肿瘤细胞的细胞膜阳性率≥25%；或当ICP>1%且IC的阳性率≥25%；或当ICP=1%且IC的阳性率=100%。（9）对于非尿路上皮癌、非浸润性癌（包括原位癌）以及淋巴管内的肿瘤细胞及免疫细胞均不作评价。（10）若判读的结果接近临界值，建议与其他有判读经验的病理医师再次一起判读。若两人出现判读不一致，建议在更多有经验的判读者之间进行病例讨论。此外如存在固定不佳、坏死区域较多、肿瘤较少或存在其他影响判定的因素时可另选一个蜡块进行IHC染色，并与原来的切片一起进行评价。
TC：肿瘤细胞，IC：肿瘤相关免疫细胞，ICP：肿瘤相关免疫细胞占肿瘤比例；除了上述结果，其他状态皆为PD-L1阴性/低表达
IC：肿瘤相关免疫细胞，ICP：肿瘤相关免疫细胞占肿瘤比例，TC：肿瘤细胞
5.PD-L1（SP263）IHC检测报告推荐模板：PD-L1（SP263）IHC检测报告包括患者信息、样本信息以及检测相关信息。（1）患者信息：姓名、性别、年龄、患者身份证号码、病理号及临床简要病史。（2）样本信息：送检科室、送检医师、临床诊断、送检日期、采集时间、采集部位、样本取材方式（活检/根治）、固定时间、诊断医师及组织病理学诊断。（3）检测相关信息：检测方法（全自动免疫组织化学平台及仪器型号/手工）、抗体克隆号、检测结果（阳性肿瘤细胞百分比、阳性IC百分比、ICP）与结果判读（SP263免疫组织化学检测阳性/高表达或阴性/低表达）。
质量控制对保证膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）IHC检测结果的准确性具有重要意义。共识意见建议实验室建立严格的质量手册、程序文件、作业指导书和质量记录体系，有完善的内部和外部质量控制和程序验证，并严格执行。从事该项检测的实验室技术人员和病理医师应接受培训和资格考核。建议实验室设置专人负责膀胱癌PD-L1（SP263）检测，对检测仪器和IHC试剂的一致性和稳定性等进行性能验证，常规设立阴性及阳性对照，定期回溯并分析本实验室检测结果，阳性率应保持相对稳定，与国内外报道的研究结果没有显著差异。参加室间质评活动是进行质量控制的有效手段，建议实验室每年至少参加一次全国性或地区级以及其他权威机构组织的培训及室间质评活动，也可通过与其他获资格认证实验室的比对测试方式进行室间质控。全自动IHC染色方法已逐步普及，采用全自动染色方法进行膀胱癌PD-L1（SP263）检测前，染色设备的方案调试和参数设定均需按仪器操作规范完成。
作为膀胱浸润性尿路上皮癌免疫治疗重要的伴随诊断和辅助诊断项目，在临床进行免疫治疗前建立规范化的PD-L1（SP263）IHC检测已刻不容缓。本共识意见旨在提出膀胱浸润性尿路上皮癌PD-L1（SP263）IHC检测的操作及判读规范，更好地为临床用药提供服务和指导，并预测患者对PD-L1免疫抑制剂治疗的反应。在规范化的检测过程中，从标本处理、蜡块选择到IHC染色流程、判读方法以及质量控制均须符合规范要求，才能得到准确的检测结果。
中华医学会病理学分会泌尿与男性生殖系统疾病病理专家组成员（以单位名称汉语拼音字母顺序排列）：Department of Pathology and Department of Immunology， School of Medicine， University of Washington（曹登峰）；Department of Pathology， Indiana University School of Medicine（程亮）；安徽医科大学病理学教研室（尹玉）；北京大学人民医院病理科（王功伟）；北京大学医学部病理学系（贺慧颖）；承德医学院附属医院病理科（李春辉）；复旦大学附属华东医院病理科（肖立）；复旦大学附属中山医院病理科（侯君）；复旦大学附属肿瘤医院病理科（甘华磊）；福建医科大学附属第二医院病理科（吴春林）；福建医科大学附属第一医院病理科（陈虹）；广东省深圳市人民医院病理科（成志强）；广西医科大学第一附属医院病理科（顾永耀）；广西医科大学附属肿瘤医院病理科（叶新青）；贵州医科大学附属医院病理科（李珀）；哈尔滨医科大学附属第二医院病理科（吴丽华）；哈尔滨医科大学附属第一医院病理科（王英炜）；海军第九七一医院病理科（张伟）；海军军医大学第一附属医院病理科（余永伟）；海南省海口市人民医院病理科（徐海霞）；河北大学附属医院病理科（王娅南）；河北省人民医院病理科（赵焕芬）；河北省唐山工人医院病理科（张志勇）；河南省人民医院病理科（郭艳萍）；湖北省肿瘤医院病理科（岳君秋）；华中科技大学同济医学院附属同济医院病理研究所（万婕）；吉林大学第二医院病理科（许传杰）；江苏省苏北人民医院病理科（肖芹）；解放军东部战区总医院病理科（饶秋、夏秋媛、周晓军）；解放军联勤保障部队第九〇〇医院病理科（余英豪）；解放军总医院第三医学中心病理科（郭爱桃）；九江学院附属医院病理科（徐晓）；空军军医大学西京医院病理科（李静）；昆明医科大学第一附属医院病理科（潘国庆）；陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院病理科（段光杰）；南昌大学第一附属医院病理科（涂露霞）；南京中医药大学附属医院病理科（章宜芬）；内蒙古医科大学附属医院病理科（袁宏伟）；青岛大学附属医院病理科（李玉军、于文娟）；山东大学齐鲁医院病理科（韩博）；山西医科大学第二医院病理科（王晨）；上海交通大学医学院附属仁济医院病理科（刘强）；石河子大学第一附属医院病理科（崔晓宾）；首都医科大学宣武医院病理科（滕梁红）；四川大学华西医院病理科（陈铌、周桥）；天津医科大学第二医院/天津市泌尿外科研究所（王爱香）；武汉大学中南医院病理科（汪必成）；厦门大学附属第一医院病理科（钟山）；新疆医科大学第一附属医院病理科（李巧新）；浙江大学医学院附属第一医院病理科（滕晓东），肾病中心（王慧萍）；浙江省宁波市鄞州人民医院病理科（钟国平）；浙江省宁波市临床病理诊断中心（王素英）；浙江省人民医院 杭州医学院附属人民医院病理科（赵明）；郑州大学第一附属医院病理科（李惠翔、王冠男）；中国医科大学基础医学院病理学教研室（苗原）；中国医科大学附属盛京医院病理科（田保玲）；中国医学科学院 北京协和医院病理科（肖雨）；中南大学湘雅医院病理科（尹红玲）；中山大学附属第一医院病理科（杨诗聪）；中山大学附属肿瘤医院病理科（曹云）
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