非结核分枝杆菌(non-tuberculous Mycobacteria, NTM)，也曾称为非典型分枝杆菌(Mycobacteria other than tuberculosis, MOTT)，是指除结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex, MTC)和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。随着医务工作者对相关疾病认识的提高、菌种鉴定技术的进步以及免疫缺陷性疾病和免疫抑制剂使用增多等因素，临床观察到的与NTM相关的疾病呈明显增多趋势[1,2]。临床对NTM感染疾病诊断和治疗需求的增加促使临床实验室检验能力不断提升。为促进实验室NTM检验水平的提高，同时提高临床医生对实验室结果的正确认知，中华医学会结核病学分会组织流行病、临床和实验室领域专家就NTM相关实验室诊断领域的重要问题进行讨论，并撰写此共识。
MTM的细菌学特点与结核分枝杆菌(MTB)类似，属于需氧菌，细胞壁富含脂质使其具备抗酸染色的特点，由于细胞壁疏水性强不利于水溶性营养物质和药物进入，因此细菌能对抗各种去污剂[3]。NTM在环境中普遍存在，以土壤和水中最为常见，水源性NTM与人类感染的关系最为密切。城市供水系统通常使用含氯制品进行杀菌，因此供水系统中能耐受氯的放线菌成为最重要菌群，其中就包括NTM。NTM具有易于形成生物膜、耐饥饿、耐极端温度的特点，决定了其能够在水中长期存活。对于大多数NTM菌种来说，最佳的体外培养温度为35～37 ℃，但有些菌种，如海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌需要较低的培养温度(28～30 ℃)，而嗜热分枝杆菌最佳生长温度是42 ℃。因此当怀疑这些菌种较常见的肺外NTM感染，如皮肤软组织、骨关节感染时，建议同时尝试不同培养温度，以提高阳性发现。
随着鉴定技术的进步，已报道的分枝杆菌菌种数量越来越多，目前已超过170种。分枝杆菌分类方法有多种，从对临床指导意义考虑，将NTM简单分为快生长分枝杆菌(rapidly growing mycobacteria，RGM)和慢生长分枝杆菌(slowly growing mycobacteria，SGM)，即可对用药选择提供有益信息。RGM在固体培养基上培养7 d内即获得肉眼可见菌落，而SGM则需要7 d以上。临床最常见的有临床价值的RGM包括脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌和龟分枝杆菌，RGM感染通常选用大环内酯类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类等药物治疗。最常见的有临床价值的SGM包括鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex，MAC，主要包括鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌)、堪萨斯分枝杆菌及蟾蜍分枝杆菌等，治疗通常选取大环内酯类和利福霉素类药物，有时候加用注射类抗结核药物。鉴于固体培养在我国的普及性，此分类方法无需特殊技术和额外操作即可实施，因此实用性强。另一种简单的分类方法依照感染部位划分NTM种类，分为肺部感染、淋巴结炎、皮肤软组织感染和播散性疾病等。这种分类方法有利于在无法及时鉴定感染菌种时，对可能感染的菌种进行推定，因此也具有一定的临床价值。
我国历次的全国结核病流行病学调查结果显示，NTM的分离率持续增高。随着结核病疫情逐步得到控制，NTM感染在分枝杆菌疾病中所占的比例将逐步提高[4]。目前在结核病疫情较低的发达国家，NTM的分离率已超过了MTC[5,6]。我国尚缺乏全国性数据，现有的关于NTM的流行病学研究结果显示，我国NTM感染呈现南方多于北方、气候温和地区多于气候寒冷地区、沿海地区多于内陆地区的特点，如以东部沿海地区报道为例，山东为1.37%，江苏为3.37%，上海为5.9%，福建为10.2%，广东为19.3%[7,8,9,10,11]。
NTM种属分布常具有地域特点，不同国家报道的NTM菌种组成、菌种构成比例多存在明显差异。Simons等[12]对东亚地区NTM菌种分布的荟萃分析结果显示：临床标本中分离最多的是MAC(67%)，东北亚地区如日本和韩国尤其多见；快生长NTM如脓肿分枝杆菌在中国大陆和台湾地区、新加坡较其他国家和地区较为多见，但欧洲和北美很常见的玛尔摩分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌在东亚地区却鲜有报道；亚洲国家NTM感染患者中37%曾罹患结核病。现有的文献提示我国分离最多的NTM菌种为胞内分枝杆菌，在北方可达40%～60%，而南方地区除了胞内分枝杆菌外，脓肿分枝杆菌也占较高比例，与北方相比，南方的NTM种类更具有多样性[7,8,9,10,12]。
目前缺乏NTM在人与人间传播的充分证据，因此对感染者没必要进行隔离。基因分型技术发现，同种NTM不同菌株的成簇率很低，表明环境是感染的重要来源。越来越多的研究发现，环境中普遍存在的分枝杆菌可能是人类感染的主要来源，尤其是水源性NTM。基因分型技术发现水源性鸟分枝杆菌与来自艾滋病患者的鸟分枝杆菌有相同的基因型；美国在1970年常规应用氯化物消毒城市用水后，儿童淋巴结炎的主要致病NTM菌种由瘰疬分枝杆菌演变为能耐受氯化物的鸟分枝杆菌；较多机会吸入水雾的人员，如室内游泳池管理员、操作淬火过程的炼铁工人、桑拿浴爱好者等，发生NTM感染的可能较大，而且感染的菌种与供水系统中NTM菌谱一致。研究发现鸟分枝杆菌在市政供水系统中普遍存在，堪萨斯分枝杆菌仅存在于管道水系中，而蟾蜍分枝杆菌则仅存在于热水管道，推测感染者主要是通过饮水或气溶胶吸入而感染。而皮肤感染往往源于直接接触，如海分枝杆菌主要通过伤口感染接触水体者，而由消毒不严格引起的手术伤口感染龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌的情况也时见报道。
人群在日常生活中普遍持续暴露于NTM。针对胞内分枝杆菌的皮肤试验显示，美国东南沿海地区60%以上年龄超过25岁的成年男子都曾感染过胞内分枝杆菌[13]。而其他同类研究如以色列针对老年人的研究及肯尼亚和韩国针对儿童的研究结果均显示人群对MTM的暴露和感染普遍存在。
以生化试验为主的分枝杆菌菌种鉴定技术虽然曾经是经典方法，但由于操作复杂、耗时而结果不准确，因此已不常使用，目前主要用于新菌种的确定。现阶段临床常用的鉴定方法依据鉴别能力分为两大类：仅能鉴别MTC和NTM的初步菌种鉴定方法；能够将NTM鉴别至种水平的菌种鉴定方法。本共识主要关注目前临床最常使用的鉴别技术。
在我国广泛开展。绝大多数的NTM菌种在含有500 mg/L PNB的罗氏培养基上能够生长，而MTC却不能耐受。较多证据表明PNB选择性培养基法用于MTC与NTM的鉴别结果可靠。虽然有少量报道某些NTM不能耐受PNB的情况，但所涉及的菌种多数在临床并不多见，因此对PNB方法的总体可靠性影响有限。少量文献报道MTC存在耐受PNB的情况，但均缺乏后续的确认研究，可靠性尚待证实。
应用PNB选择性培养基法应注意以下情况：(1)对于待测菌株在PNB培养基上生长，最初判断为NTM的菌株经其他鉴定方法进一步确认为MTC的情况，需考虑PNB培养基在制备和应用过程中操作不当和混合感染等因素。建议将对照培养基和含PNB培养基上生长的菌落分别进行鉴定，如果对照培养基菌落为MTC，PNB培养基上生长的菌落鉴定为NTM，考虑为混合感染；如果2种菌落均鉴定为MTC，则考虑为操作失误所致。(2)MTC与NTM混合感染时可能会造成实验室鉴定结果的不一致，需要给予关注。
MPT64抗原是MTC在液体培养基中生长时主要分泌的蛋白之一，NTM培养滤液中多不存在此分泌蛋白，由此可以进行初步菌种鉴定。已有多种相关商业检测试剂上市，多采用免疫层析法检测培养滤液中MPT4抗原是否存在，具有操作简单、用时短等优点[14,15]。已获得的诊断效率数据显示，就初步鉴定MTB与NTM而言，此技术具有很高的敏感度(多数报道超过97%)和特异度(多数报道超过97%)。
应用MPT64抗原检测法时应注意以下情况：(1)本技术用于检测分枝杆菌在生长过程中是否分泌MPT64抗原，因此需要首先获得阳性培养物；(2)当MTC编码MPT64抗原的基因发生突变时，会出现假阴性结果，这种情况的发生率多为0%～3%；(3)有些M. bovis BCG株(如巴斯德株、哥本哈根株等)缺乏分泌相应抗原的能力，检测呈阴性结果；(4)检测敏感度与MPT64抗原的分泌量有关，有些情况下获得阴性结果的标本延长培养时间后可获得阳性结果；(5)个别NTM菌种，如海分枝杆菌和浅黄分枝杆菌可产生微量MPT64抗原，因此检测呈弱阳性结果；(6)当MTC与NTM共同生长时，将报告阳性结果，因此无法反映NTM的存在。
即通常所说的聚合酶链反应(PCR)技术。目前已经有多款用于结核病诊断的PCR试剂盒上市，其扩增的靶序列往往是MTC中特异性的DNA序列，如IS6110、MPT64、ESAT-6及CFP-10等。将PCR技术与涂片和培养结合可用于NTM的初步筛查。对于涂片阳性或是培养阳性的标本，平行的PCR扩增获得阳性结果提示样品中存在MTC菌，反之，当PCR为阴性结果时，应考虑存在NTM的可能，但需要进一步核实。
应用PCR技术结合涂片或培养筛查NTM时应注意以下情况：(1)多种因素可以影响PCR扩增效率，如DNA提取效率、扩增抑制物的存在等，导致假阴性结果；(2)扩增靶序列在少量MTC菌株中天然缺失，如少量MTC菌株IS6110序列的拷贝数为零[16]，这种情况可能引起误判。
虽然目前菌种鉴定水平已能够满足临床的主要需求，但持续提高菌种鉴定水平有利于进一步提高临床诊疗水平，如将脓肿分枝杆菌进一步划分后发现，与阿奇霉素相比脓肿分枝杆菌亚种更易于发生克拉霉素耐药，而马赛分枝杆菌对2种药物的耐药性无差别，由此可解释临床含克拉霉素的方案对马赛分枝杆菌感染患者的疗效优于对脓肿分枝杆菌亚种感染患者的现象[17]。依据鉴定的原理，目前NTM菌种鉴定主要包括2大类方法：比较同源基因或序列差异的分子诊断技术和分析细菌菌体组成成分差异的鉴定技术。
(1)直接的同源基因或序列比较方法：通过分析同源DNA序列组成差异鉴定细菌至种水平，是目前菌种鉴定的"金标准"。可用于菌种鉴定的DNA序列既要求在不同的菌种间具有较高的序列保守性，实现应用通用引物对不同菌种目标序列的扩增，又要求不同菌种的同源序列具有一定水平的差异，以实现鉴别区分的目的。目前最常用的同源序列有16S RNA编码基因(16S DNA)、16S-23S rRNA基因间区(internal transcribed spacer，ITS)、RNA聚合酶的β-亚基(RNA polymerase subunit，rpoB)和热休克蛋白65(hot shock protein 65，hsp65)的编码基因，仅就鉴别能力来看，hsp65优于rpoB和ITS，而16S DNA的鉴别能力最低[18,19]。应用单一的DNA同源序列进行菌种鉴定至少在以下几方面存在不足：①单一的DNA同源序列分辨力不足，一些亲缘关系相近的分枝杆菌无法被准确鉴别，如16S DNA在分枝杆菌属不同菌种间序列相似性为94.3%～100%，单靠这一序列无法准确区分具有临床价值的堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌、海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌、玛尔摩分枝杆菌和苏尔加分枝杆菌等。②由于针对每个单一序列的公用数据库都可能存在信息不全，或是由于公用数据库在上传DNA序列时缺乏质量控制等情况，有引起错误鉴定的可能。③一些新的菌种或亚种的鉴定往往是在联合应用了更多同源序列的情况下被发现，如联合16s DNA和ITS鉴定为脓肿分枝杆菌的菌群，在结合使用hsp65和rpoB基因后，进一步分为脓肿分枝杆菌亚种、M. bolletii亚种和马赛分枝杆菌。随着分子标识的增多，未来分枝杆菌菌种鉴定工作将更加细致。应用同源序列比较进行菌种鉴定的建议：①16S DNA鉴别能力虽然相对较低，但由于目前其相关数据库最为完整，因此推荐常规使用。②ITS、hsp65和rpoB基因鉴别能力相对较高，建议至少选择其中之一与16S DNA平行使用，以提高菌种鉴定的分辨能力。③在序列比较过程中对于种内序列差异较大的情况，应增加分子标识的检测数量，以期提高分辨率、发现新的种或亚种。(2)间接的同源基因或序列比较方法：目前已经商业化的试剂盒通过设计针对特定同源基因或序列(如16s DNA、ITS等)特定的单核苷酸多态性位点的探针，并将探针标记在固相的基质上(如纤维素膜、芯片等)，通过探针与待检测序列的结合情况来间接判断DNA序列的组成，从而达到鉴别菌种的目的[20,21]。通常情况下，对单核苷酸多态性位点的选择主要考虑能够将临床最常见的NTM鉴别出来的位点，因此，用于菌种鉴定的商业试剂盒能够解决主要的临床需求，但对于临床较为少见的菌种或是当进一步区分亚种对临床有指导意义时，仍需借助其他方法进行鉴定。本方法虽然鉴别能力较直接的基因序列分析弱，但简化了操作，并且具备鉴定临床常见NTM的能力，因此具有临床应用价值。应用商业化的分子菌种鉴定试剂盒的注意事项：①目前商业化的菌种鉴定试剂盒仅能鉴别临床最常见NTM中的部分菌种，因此对于分离NTM菌种较多的地区，建议对无法鉴定的菌种进一步采用其他方法鉴别。②目前的商用试剂盒主要用于分离株的鉴定，由于获得培养物时间较长，无法及时为临床提供信息；虽然有些试剂盒也可用于涂片阳性临床标本的检测，但当菌量较少时，存在检测失败的风险。
较为成熟的技术包括应用高效液相色谱技术分析细菌细胞壁的分枝菌酸碳链结构和应用飞行质谱分析多种蛋白成分在菌体中所占的比例。细菌的脂质和蛋白质的组成具有种属特异性，这2种方法均已经建立了包含丰富菌种的图谱库用于结果比对，因此具有很高的鉴别能力。但以上2种方法均用于临床分离株的鉴定，因此不利于临床的及时诊断。相比而言，分枝菌酸结构分析技术操作复杂、试剂不开放、价格昂贵，而飞行质谱具有操作简单快速、耗材成本低等特点，但二者所需设备昂贵，因此限制了临床应用。
虽然美国临床与实验室标准化研究所(CLSI)对于一些NTM菌种有推荐的药敏试验方法和药物临界浓度，但这些方法仍有待临床充分地评价和调整[23]。开展没有推荐方法的菌种的药敏试验时，常规做法是慢生长分枝杆菌多参照MTB选取临界药物浓度，而快生长分枝杆菌多参照普通细菌选取临界药物浓度。但不同种的分枝杆菌的耐药临界浓度可能存在明显差异，因此需要开展更多的临床和基础研究，以建立针对不同菌种的药敏试验方法。从目前已获得的数据来看，NTM感染的治疗效果主要取决于菌种，如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和溃疡分枝杆菌的疗效较好，而MAC、脓肿、龟分枝杆菌的治疗疗效较差，表明种属对药物的敏感性至关重要。只有同一菌种不同菌株对药物的敏感性存在分化时，才有必要开展药敏试验。
NTM药敏试验的注意事项：(1)应在菌种鉴定的基础上开展NTM药敏试验。不同NTM菌种耐药临界点有较大差别，以克拉霉素为例，MAC的耐药临界点为32 mg/L，而快速生长分枝杆菌的耐药临界点则为8 mg/L，未行菌种鉴定的药敏试验结果有可能误导治疗方案的制定。(2)药敏试验前应先评估NTM菌株与疾病的相关性。不建议常规对分离到的与疾病相关性较低的NTM进行药敏试验，避免浪费医疗资源。(3)多数NTM对药物的体外敏感度与临床疗效间尚未建立起充分的关联，现有数据仅支持MAC的疗效与细菌在体外对大环内酯类药物的敏感性有关。(4)在缺乏肯定的体外药敏试验方法前，建议体外药敏试验以梯度浓度的方法检测菌株的耐药程度，并结合患者使用的相应药物在体内的血药浓度来判定其可能的抗菌效果。
NTM和MTC有相同或类似的药物靶位，但NTM对很多抗结核药物天然耐药，表明NTM细胞壁通透性、药物外排泵、药物与靶位的低亲和力等其他因素较基因多态性在NTM耐药中发挥着更为重要的作用。随着研究的深入，发现某些特定菌种对某些药物耐药的机制与特定的耐药基因有关[23]，如MAC耐大环内酯类药物与23S核糖体RNA基因(rrl)的基因突变高度相关；16S核糖体RNA基因(rrs)突变与脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌对阿米卡星耐药相关；rpoB基因突变与堪萨斯对利福平耐药相关。有限的研究结果提示，一些已知基因的单核苷酸多态性可能与耐药有关，但现有的数据仅报道了个别药物中较低比例的耐药菌株可能与某一基因的序列多态性有关，因此，未来耐药分子机制方面亟待更深入的研究，才有助于未来应用分子手段尽快发现耐药菌株[24]。
由于NTM广泛分布于环境之中，因此从临床样本中分离出NTM并不一定提示NTM病，必须排除样本污染和细菌定植的可能。美国胸科协会发布的NTM肺病诊断标准明确指出，此诊断标准仅适用于鸟分枝杆菌复合群、脓肿分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌等常见致病的NTM，并不适用偶然分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌等较少致病的NTM[25]。对来自临床标本的NTM临床分离株，细菌与疾病的相关性至少应该考虑以下因素。
文献报道临床相关性较高的NTM包括玛尔摩分枝杆菌(95%)、苏尔加分枝杆菌(76%)、MAC(56%)、脓肿分枝杆菌(35%)和龟分枝杆菌(31%)，而经常分离到的偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌和土分枝杆菌临床相关性较差(1%～3%)[26,27,28]。美国第一次NTM流行病调查报告发现：分离出海分枝杆菌和堪萨斯分枝杆菌的患者诊断为NTM病的比例最高，其次为苏尔加分枝杆菌、鸟分枝杆菌复合群和龟-脓肿分枝杆菌，而戈登分枝杆菌和土分枝杆菌则不致病[5]。国外随后的报道也进一步显示，临床标本分离出戈登分枝杆菌和土分枝杆菌多由于标本被NTM污染。
从无菌部位分离出的NTM往往意味着致病，但从非无菌部位如痰和支气管灌洗液中分离的NTM要排除标本污染或呼吸道定植的可能[29]。以偶然分枝杆菌为例，如果血培养发现偶然分枝杆菌往往诊断为播散性偶然分枝杆菌病，但痰标本分离出偶然分枝杆菌多为呼吸道定植或标本污染[30]。由于绝大多数NTM菌株由痰标本分离获得，因此需审慎地分析其临床意义。
在欧洲和加拿大蟾蜍分枝杆菌常致病，但在美国蟾蜍分枝杆菌很少致病。在荷兰胞内分枝杆菌很少致病而鸟分枝杆菌常致病，但在美国德克萨斯胞内分枝杆菌常致病而鸟分枝杆菌很少致病。因此，有必要开展基于本地区的NTM临床相关性研究。分析本地区不同种NTM临床相关性的意义：(1)对于既往研究中发现的与临床高度相关的NTM，当患者第一次分离出这种细菌时提示较大的感染可能；(2)临床相关NTM菌谱有明显的地区差异，这些结果相对实验室NTM分离情况更加真实地反映了该地区NTM感染情况；(3)通过NTM临床相关性的研究可发现一些NTM疾病相关的人口学、合并疾病和影像学特征，为临床诊断各种NTM感染性疾病提供诊断依据。
NTM可引起身体各部位的疾病，但以肺部感染最为常见，约占NTM感染的90%，其他相对较常见的受累部位包括淋巴结、皮肤软组织、骨以及全身播散性病变，但也有中枢神经系统、角膜和耳部感染的个案报道[31]。不同类型的临床标本虽然都有可能分离获得NTM，但以痰、支气管肺泡灌洗液、肺活检组织获得NTM培养阳性的可能性最大。肺部NTM感染最常见的菌种包括MAC、脓肿分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和蟾蜍分枝杆菌。NTM引起的肺外感染以淋巴结炎最为常见，尤其是6个月至2岁的儿童，最常见的致病菌为MAC，其次为瘰疬分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌；NTM引起的骨关节病变较为罕见，且MAC、苏尔加、偶然、蟾蜍、海等分枝杆菌可能较为常见。皮肤软组织的NTM感染常与特定人群有关，感染发生前患者往往经历过外伤、手术或皮肤美容护理，其中水产业人员易于发生海分枝杆菌感染，龟分枝杆菌或偶然分枝杆菌引起的伤口感染时见报道，而溃疡分枝杆菌和脓肿分枝杆菌也可见于皮肤感染。侵犯回肠的克隆病的病因目前已认定为是副结核分枝杆菌引起的感染。在艾滋病患者中，由MAC，尤其是其中的鸟分枝杆菌引起的感染很常见，在播散性感染者中尤以鸟分枝杆菌感染最为常见，而堪萨斯分枝杆菌和其他分枝杆菌感染的报道也逐渐增多。
随着我国结核病疫情逐步得到控制，可以预见我国的NTM感染问题将越来越突出。NTM无论是实验室诊断还是临床治疗还存在诸多问题和困难，需要实验室人员和临床医生给予持续关注。
编写组专家(排名不分先后)：许绍发、张宗德、李亮、马玙、端木宏谨、傅瑜、黄海荣、唐神结、段鸿飞、姜广路(首都医科大学附属北京胸科医院)；屠德华、王甦民(北京结核病控制研究所)；王国治(中国药品生物制品检定所)；赵雁林、万康林(中国疾病预防控制中心)；申阿东(首都医科大学附属北京儿童医院)；吴雪琼(解放军第三○九医院)；陈晋(同济大学附属上海市肺科医院)；谭耀驹(广州市胸科医院)；李辉(河南省疾病预防控制中心)；李文慧(中华医学会《中华结核和呼吸杂志》编辑部)
