对于胚系遗传疾病，首选乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集外周血，也可采用血斑、颊黏膜脱落细胞等，方便核酸提取（Ⅰ，A）^［24］。

进行基因诊断前，除详细采集病史和家族史外，应完善患者相关临床检查，包括耳外形检查、听力学检查、颞骨影像学检查、颅脑磁共振等；如考虑综合征型耳聋，还应进行其他器官系统检查，如皮肤、毛发、指甲，骨骼发育、体态、步态，虹膜和巩膜颜色、视力、视野、眼底等，必要时结合超声、血液生化、影像（X线、CT、MRI）检查等以明确临床诊断。

用于遗传性耳聋基因诊断的主要方法包括基因芯片（gene chip）、Sanger测序、目标耳聋基因靶向捕获测序（即已知耳聋基因二代测序Panel）、全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）及全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）等。基因芯片是杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，主要检测已知耳聋基因的热点致病性变异，其主要优点是快速、高效、自动化，但检测范围有限。Sanger测序，即第一代DNA测序技术，被认定为基因检测的金标准，读长较长、准确性高，但其单个碱基的测序成本高、通量低。目标耳聋基因靶向捕获测序、WES和WGS均以下一代测序（next-generation sequencing，NGS）技术为基础，NGS相比第一代测序大幅降低了单个碱基的测序成本和测序时间，保持了较高的准确性和检测通量。NGS技术检测出的致病、可能致病或意义不明的变异，应使用Sanger测序进行验证（Ⅱa，A）。

随着测序成本的下降以及生物信息学分析的规范化和流程化，目标耳聋基因靶向捕获测序和WES逐渐成为遗传性耳聋基因诊断的重要手段。文献报道的超过100例耳聋患者的基因诊断中：（1）包括59~181个基因的耳聋基因靶向捕获测序，能在38.8%~39.3%的散发耳聋患者中明确诊断分子病因^{［25, 26］}，在33.5%~47.6%的散发和家系耳聋患者中明确诊断分子病因^{［5，27, 28］}，在48%~56%的家系耳聋患者中明确诊断分子病因^{［29, 30］}；（2）排除由GJB2或排除由GJB2、SLC26A4、线粒体DNA m.1555A>G致聋的患者后，包括79~213个基因的耳聋基因靶向捕获测序，能在15.5%~31%的耳聋患者中明确诊断分子病因^{［31, 32, 33, 34, 35］}；（3）WES能在47.3%的散发耳聋患者中明确诊断分子病因^［36］，而排除由GJB2基因致聋的患者后，WES能在35.5%的散发耳聋患者中明确诊断分子病因^［37］，在56%的家系耳聋患者中明确诊断分子病因^［38］。可见，与散发耳聋患者相比，有家族史的耳聋患者应用NGS能获得更高的分子诊断率；与耳聋基因靶向捕获测序相比，WES无论在散发还是有家族史的耳聋患者中都具有更高的分子诊断率；遗传性耳聋具有明确的常见致聋基因（如GJB2），优先检测常见致聋基因不失为一种经济高效的策略。

关于检测基因的选择，遗传性耳聋虽主要为单基因疾病，但遗传异质性强，除少数遗传性耳聋类型对应明确的致病基因外，其他类型难以通过表型判断致病基因。针对表型、基因型对应性不明确的遗传性耳聋，本指南推荐优先检测明确的耳聋致病基因（ClinGen经过评估认为该基因与疾病相关性是“Definitive”或“Strong”）（Ⅰ，A）^［39］。若检测可能的致病基因（ClinGen经过评估认为该基因与疾病的相关性是“Moderate”）^［22］，对发现的基因变异致病性评级应遵循下调一级的原则，并结合不同证据进行综合判断，如特异性临床表型、家系共分离证据、功能实验等，并谨慎解释（Ⅱa，B）^［40］。考虑到国内同证婚配频发的现象，同一患者有可能携带多种基因的致病变异，医学检验实验室及临床医生需对数据谨慎分析及解释。

对于表型、基因型对应性明确的遗传性耳聋类型，可以有针对性地进行特定基因检测，如颞骨CT显示单纯前庭水管扩大（enlarged vestibular aqueduct，EVA）的患者可进行SLC26A4基因检测（Ⅱa，A），显性遗传耳聋甲发育不全（dominant deafness-onychodystrophy，DDOD）综合征可以检测ATP6V1B2基因、内耳畸形IP-Ⅲ可检测POU3F4基因（Ⅱa，B）。临床医生对表型的认识决定了选择基因检测范围的准确性及全面性。在检测费用相当的情况下，基于NGS的目标耳聋基因靶向捕获测序是首选方法^{［25，28，41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48］}。考虑到患者的经济条件，也可以进行梯级遗传检测。梯级遗传分析是以表型-基因型及家系分析为核心技术，分步骤鉴定遗传性耳聋的致病基因^{［49, 50, 51］}。具体如下：（1）对前来咨询的耳聋先证者首先结合表型进行临床诊断，对于可以从表型推断基因型的耳聋患者可直接检测致病基因并进行家系验证，确定其遗传病因；（2）对于无法从表型推断基因型的耳聋患者，进行常见耳聋基因测序，对结果阳性的患者进一步行家系成员验证，明确致病基因变异；（3）对于常见耳聋基因检测阴性的患者，进行已知耳聋基因二代测序Panel检测，如发现候选变异则进一步在家系中进行验证，确定致病基因变异，如仍未发现候选变异，则通过WES（必要时结合连锁分析）寻找新的致病基因。图1为耳聋基因诊断流程图。

当NGS未检测出致病基因变异或检测出的致病基因变异不足以解释患者表型或家系遗传规律时，应酌情采用其他方法进行检测，如多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA），基因芯片、WGS、三代测序技术（third-generation sequencing，TGS）等以检测大片段变异等情况^{［52, 53］}。例如STRC基因致病变异（主要是拷贝数变异，copy number variation，CNV）是导致轻中度听力损失的主要原因之一，高度同源的假基因的存在对NGS检测构成挑战。因此临床实践中检测STRC基因CNV需结合MLPA、微滴式PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、长片段PCR（long-range PCR，LR-PCR）或长读长的TGS等有效手段^{［53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63］}（Ⅱa，B）。

下一代测序能否有效服务于耳聋基因诊断不仅依赖于检测技术的更新，还与数据分析及变异解读密不可分。越来越多的检测中心开始采用美国分子病理学会（Association of Molecular Pathology，AMP）和美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）提出的序列变异解读指南^{［22，64］}。但现阶段，上述变异解读指南仍有局限性，耳聋基因诊断过程中仍会有大量变异被判定为临床意义不明（variants of uncertain significance，VUS），随着携带相同变异的人群数据的积累及生物信息学技术的发展，指南会被修订以利于变异性质的判定。此外，无论是WES还是WGS，其主要目的是揭示可解释患者临床表型的致病基因（组）变异，但在部分个体基因组中还可能检测出与受检指征不相关但具有重要临床功效性（主要是指能较好预测未来发病的可能性并可进行预防性干预或治疗）的基因（组）变异。如果这些变异是无意中被发现的，则称为意外发现^［65］。ACMG建议有意识地分析这些有重要临床意义的基因（组）变异，并将其称为次要发现^［66］。意外发现和次要发现虽然一方面为检测者提供了有用的遗传信息，但同时也会不同程度地增加受检者的精神压力和心理负担，为遗传咨询带来更多的挑战^{［67, 68］}。次要发现是否报告，需要考虑相关基因致病的严重性、外显率、现有的治疗模式对患者的影响和/或负担、对其进行筛查的可实施性等。ACMG次要发现工作组目前建议报告的列表里主要包括肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病相关基因。是否报告WES或WGS的次要发现，基因检测实验室应与临床医生沟通，并做好受检者的检测前咨询^［69］。

针对检测出的基因变异，应按照ACMG分类标准对其进行致病性判读（Ⅱa，A）^［70］。出具的检测报告应包括检测方法、检测范围（检测基因及可检出的变异类型），检测质量及最终的检测结果、诊断和建议等^［71］。报告的形式应简明扼要，所列内容定义明确，结果解读依据充分，同时应明确说明检测报告的适用范围和局限性。检测报告应包括以下4方面内容。（1）一般信息：检测单位或实验室信息、受检者信息、送检单位和医师信息、报告出具和签发时间等。（2）检测信息及局限性：包括说明检测技术的范围和方法、具体描述其局限性等信息；应说明分析所包含的变异类型，如是否包含结构变异和线粒体变异等，以及是否采用其他方法对结果进行验证。（3）检测结果的报告、解读和结论：检测结果中需列出具体的变异位点信息，包括基因名称、所参考的人类基因组版本号、基因或转录本参考序列（NM-编号）和版本号、核苷酸变异、氨基酸变异、外显子/内含子序号、等位基因杂合性、染色体编号和坐标、变异的来源、变异的人群频率等，提供对该变异致病性的判断以及相关的支持依据和文献。建议报告与临床表型相关的致病、疑似致病及意义不明的变异；对于与临床表型无关但有临床意义的次要发现，依受检者意愿决定是否报告；应对检测到的基因变异及其分类进行解读，包括对致病性与否进行具体解释，其所导致的相关疾病应进行简单解释和说明，并给出基于变异分类的报告结论。（4）遗传咨询和建议：报告应明确说明仅供具备遗传咨询或临床遗传医师资质的专业人员进行遗传咨询或下一步临床决策时参考。必要时，报告可以给出便于后续遗传咨询的建议，如建议结合获得的临床信息或其他相关信息进一步明确遗传变异的致病性^［67］。

任何基因检测方案都有一定的局限性，主要包括检测基因的多少、针对的变异类型［单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入缺失（insertion and deletion，Indel）、CNV或结构变异（structure variantion，SV）］、涉及检测基因的位置（目前主要检测基因的编码区和剪切区）、假阳性及假阴性，以及生物信息学分析的局限性。针对NGS可能出现假阳性或假阴性结果、特定变异类型无法检测以及目标区域漏检等问题，应采用Sanger测序及其他相关技术对NGS结果进行补充及验证（Ⅰ，C）。具体举例，GJB2基因主要由2个外显子组成，即外显子1（exon 1）和外显子2（exon 2），编码区存在于exon 2，大多数GJB2致病变异也集中于此，但在该基因的非编码区也会检测到致病变异。位于非编码区剪接位点上的c.-23+1 G>A变异在部分地区被认为是仅次于c.235delC的第二个常见热点变异（由该位点参与且确诊的GJB2遗传性耳聋在俄罗斯聋人群体中的比例为11.7%，在伊朗聋人群体中的比例为7.7%、蒙古聋人群体中为6.5%）^{［72, 73, 74, 75］}，在212例携带GJB2基因编码区单杂合致病性变异的中国聋人中检测c.-23+1 G>A，其中4例（1.89%）因携带该位点变异而被确诊为GJB2遗传性耳聋患者^［76］。因此，尽管该位点不在GJB2基因编码区，仍应纳入耳聋基因诊断的范围。

检测前咨询是使患者及其家属对基因检测的目的、意义和预期结果有一定的认识，并能充分了解检测结果对患者及其家庭成员的潜在影响以及相关替代方案，以供患者及家属选择。关于是否告知检测目的外的意外发现，应在检测前征求患者及家属意见并获得知情同意^［69］。

检测前咨询的主要内容包括：（1）收集和分析患者的临床资料及家族史（至少3代），初步作出临床诊断，判断遗传性耳聋的概率及可能的遗传模式。（2）告知检测的具体项目、目的和意义，以及检测的机构和费用。（3）预期结果及可能的风险：检测结果为阳性，即在与受检者耳聋相关的基因中找到致病性/可能致病性变异；检测结果为阴性，即未发现与受检者耳聋相关的致病性/可能致病性变异；结果不确定，即在与受检者表型相关的基因中找到意义不明的变异，或在与受检者表型可能相关但是不确定的基因中找到致病性/可能致病性变异；同时，受检者应知悉次要发现的可能及其意义和风险。（4）告知检测方法可能存在的局限性以及需要进一步检测的可能。（5）征求患者及其家属的意见，是否报告检测目的以外的意外基因变异。（6）告知检测结果对家庭其他成员的潜在影响。（7）告知替代检测方案。（8）告知数据及样本处理的相关规则。

检测后咨询主要是为临床医生及患者就基因检测报告进行针对性的解释及咨询，提供相关的医学建议和指导^［84］。

检测后咨询的主要内容包括：（1）告知基因检测结果，对结果进行针对性的解释和临床判读。（2）解释耳聋的病因、自然病史、临床表现、可能的干预和治疗措施以及预后情况。（3）分析和确定遗传方式，评估疾病或症状的发生和再发风险以及提供生育方面的建议。（4）结合心理评估，识别患者及其家属在情感、社会、教育以及文化等方面的理解和接受情况。（5）为患者及其家属提供有效的医学、教育、经济以及心理等社会资源，包括权威性的信息源（书籍、文献、网站等）、专家库、互助组织等信息。（6）引导患者及其家属参与诊断及研究项目，提供知情同意的解释。

检测后咨询内容可以《全基因组测序在遗传病检测中的临床应用专家共识》中的建议为框架^［67］，具体包括：是否可根据检测结果作出明确的基因诊断或明确受检者是否为耳聋基因变异携带者；是否需要针对性的辅助检查来进一步明确检出变异的致病相关性，尤其是对意义不明的变异；是否需要进一步对受检者或家庭成员进行检测验证或排除诊断；根据基因检测结果，是否需要进行适当的治疗干预，明确药物禁忌等；根据作出的基因诊断对患者的病情发展及预后等进行评估，制定治疗及随访观察计划；为患者和家属提供心理干预或社会救助资源和渠道等；根据遗传规律评估父母的再生育风险并给予再生育指导，包括产前诊断或胚胎植入前诊断等；患者或先证者的下一代风险评估及其再生育指导；家族内其他家庭成员的风险评估；疾病相关研究进展信息等。需要注意的是，如受检方要求进行产前诊断或辅助生殖等，则需根据相关共识或指南明确告知其风险，进行相应的指导或咨询。

针对第三方检测机构的报告进行遗传咨询时，医生应先针对检测质量、报告中变异评估证据、可疑变异一代测序验证结果、变异在家系中是否与耳聋表型共分离等作出综合评估。如果检测结果可靠，再为患者进行结合其表型与检测结果的遗传咨询；如果遇到检测报告信息提供不全或结果有争议的情况，要申请第三方检测机构提供更全面的信息，甚至修正结果后再进行遗传咨询。

需要注意的是，目前已知的多数遗传性耳聋致病基因变异表现为典型的单基因病，传递方式遵循孟德尔遗传定律，具有相对固定的基因型-表型对应关系和较高的临床表型外显率，其基因诊断可为遗传阻断、生育指导和临床干预提供明确依据。另一方面，经近年来系列研究提示和专家共识确认，以GJB2基因p.V37I（c.109G>A）隐性突变为代表的部分耳聋遗传易感性基因型虽可导致以轻中度为主的听力障碍，但具有明显的不完全外显性，甚至在一定比例的听力正常人群中也有携带，该类变异导致的表型可能受遗传背景和环境因素的综合影响^{［85, 86］}。最新的一项基于我国3万例以上不同年龄普遍人群的横断面研究显示，p.V37I双等位基因（纯合及复合杂合）变异携带者在出生后只有14.63%经新生儿听力筛查和转诊被识别为听力障碍，中度及以上听力损失（≥35 dB HL）的外显率随年龄增加而递增，在20~40岁为23.08%，40~60岁为59.38%，60~85岁为80%^［87］。鉴于GJB2基因p.V37I变异在我国人群中具有较高的携带率（等位基因频率约为0.06），建议与之相关的耳聋遗传咨询应与其他案例有所区别。

在极少数情况下，同一遗传性耳聋患者可携带多个耳聋基因的致病变异，即由多个致病原因致聋，仅对常见耳聋基因进行检测可能导致遗传病因分析不全面。因此，检测信息不足可能影响遗传咨询师提供全面的咨询建议^{［88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95］}。